陳世鈺，崔 帥，蔣亞君，鑫 婷，王 洋，郝玉欣，黃建新，郭曉宇，朱鴻飛，吳佳俊，賈 紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618；3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，大理 671003)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病。ASFV是一種核質(zhì)大DNA病毒，長度介于170～190 kb[1]，共含有150多個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中34個編碼結(jié)構(gòu)蛋白，但目前仍有很多蛋白功能未知[2-3]。1921年ASF首次在肯尼亞暴發(fā)[4]，隨后在撒哈拉以南非洲大部分地區(qū)和撒丁島流行[5]。ASFV在20世紀50年代首次進入歐洲，到1995年從西班牙和葡萄牙徹底根除[6]。2007年歐洲再次暴發(fā)疫情，并傳播至烏克蘭、歐盟東部國家、波蘭、俄羅斯等國家[1,7]。2018年中國遼寧首次報道ASF疫情[8]，隨后傳播至全國，造成巨大的經(jīng)濟損失。ASFV傳播方式多樣，主要通過易感動物直接接觸傳播，或污染的豬肉、車輛、人及蜱間接傳播[9]。發(fā)病動物表現(xiàn)高熱、出血和多器官病變，短時間內(nèi)死亡。試驗性感染后7～10 d出現(xiàn)臨床癥狀，可被視為感染晚期[10]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種非編碼、長度>200 nt的RNA分子，位于細胞核或細胞質(zhì)中，具有一定功能，可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀修飾等多個水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達[11-12]，在細胞增殖、自噬、凋亡及疾病發(fā)生發(fā)展等多個過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用高通量測序技術(shù)成功構(gòu)建了豬外周血淋巴細胞的lncRNA文庫，通過GO功能和KEGG信號通路富集分析，初步鑒定出影響Toll樣受體信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步闡述病毒炎癥反應(yīng)和病毒復(fù)制等提供了一定理論依據(jù)，為ASF的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及毒株 10頭英系大白豬購自北京市SPF豬育種管理中心，所有豬檢測ASFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)及其抗體，結(jié)果均為陰性。本試驗所用毒株ASFV CADC-HN09株由中國動物疫病預(yù)防控制中心提供。試驗動物飼養(yǎng)于中國動物疫病預(yù)防控制中心P3實驗室

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol?Reagent、Plant RNA Purification Reagent、UNG酶、Qubit 4.0(Invitrogen公司)；TruseqTMSmall RNA sample pre Kit、cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS、Novaseq 6000 SBS Kit v3-HS(200 cycles)(Illumina公司)。NanoDrop2000分光光度計(Thermo公司)；瓊脂糖(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒、lnRcute lncRNA First-Strand cDNA Kit、lnRcute lncRNA qPCR Kit(SYBR Green)、DL2000 DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)。實時熒光定量PCR儀(型號：ABI 7900HT)。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及處理 將豬分為試驗組(5頭)和對照組(5頭)，分別接種1 mL 102HAD50的ASFV強毒和等劑量的PBS。于第7天采集前腔靜脈血，用淋巴細胞分離試劑盒分離淋巴細胞，細胞樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與質(zhì)量檢測 試驗組和對照組各隨機選取3個樣品進行高通量測序。采用TRIzol法提取樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品完整性，NanoDrop2000分光光度計檢測樣品濃度與純度。其中，28S/18S為1.8～2.2，RIN值>7代表提取RNA完整性較好；濃度≥50 ng/μL、總量不低于1 μg即滿足建庫要求。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量控制 基于邊合成邊測序(sequencing by synthesis，SBS)技術(shù)，采用Illumina 高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序，產(chǎn)出大量的高質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)(Raw data)，其大部分堿基質(zhì)量分值能達到或超過Q30。對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾，去除測序接頭序列、低質(zhì)量讀段、含N比例超過10%的序列及長度過短序列，得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)(Clean data)。

1.2.4 參考基因組比對分析 質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)，即Clean data(reads)，因測序片段是mRNA隨機打斷的，為確定這些片段由哪些基因轉(zhuǎn)錄而來，使用HISAT2數(shù)據(jù)庫將質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)比對到豬參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid9822[Organism:exp])，進而獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達量計算等的Mapped data，同時對該次轉(zhuǎn)錄組進行測序比對。

1.2.5 lncRNA差異表達分析 獲得所有l(wèi)ncRNA表達量后，對表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，進而篩選不同樣本之間顯著差異的基因。篩選過程以log2|FoldChange|≥1且P<0.05為標準，滿足條件的為顯著差異lncRNA,并對篩選到的差異lncRNA進行可視化展示。

1.2.6 差異表達lncRNA靶基因預(yù)測及富集分析 對差異表達lncRNA采用反式調(diào)控(trans法)進行靶基因預(yù)測，即當(dāng)lncRNA與一些距離較遠的基因在表達量上存在正相關(guān)或負相關(guān)的情況時，就可通過樣本間lncRNA與蛋白編碼基因的表達量相關(guān)性分析來預(yù)測其靶基因，并對篩選到的差異表達lncRNA進行靶基因GO功能和KEGG信號通路富集分析。

1.2.7 Toll樣受體信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)GO功能和KEGG信號通路富集分析結(jié)果，篩選Toll樣受體信號通路，挖掘出調(diào)控該通路的內(nèi)源性lncRNA及相關(guān)靶基因。根據(jù)差異表達的內(nèi)源性lncRNA預(yù)測其反式調(diào)控的靶基因mRNA，初步挖掘調(diào)控該通路的lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.8 實時熒光定量RT-PCR驗證篩選的lncRNA 為確保測序結(jié)果的準確性，通過實時熒光定量RT-PCR方法進一步驗證所篩選lncRNA。以U6作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR體系和程序參照試劑盒要求進行。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)

2組樣品經(jīng)過高通量測序后，得到Raw reads，結(jié)果見表2。原始文庫經(jīng)過去除低質(zhì)量和受污染的序列后，獲得Raw reads 519 473 712條，Clean reads 504 387 798條，而純凈序列/原始序列集中在92%～98%，說明低質(zhì)量數(shù)據(jù)較少，測序效果良好。對照組GC含量在50%左右，而試驗組GC含量卻維持在56%以上，說明病毒感染導(dǎo)致宿主基因組中GC含量升高。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.2 比對效率

使用HISAT2數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進行注釋并將其定位到豬參考基因組，分析序列在基因組上的分布情況，結(jié)果見表3。由表3可知，純凈序列的總體比對率在79%～93%，將其去重后的唯一比對率稍有下降，維持在63%～90%，以上結(jié)果表明，僅有少量reads可比對到參考基因組多個位置，多數(shù)reads為唯一匹配。

表3 比對率統(tǒng)計

2.3 差異表達的lncRNA

利用高通量測序技術(shù)對差異表達的lncRNA進行分析，以log2FoldChange為橫坐標、log10FDR為縱坐標對6個樣本中的差異lncRNAs繪制火山圖(圖1)，直觀反映了樣本間差異表達的分布情況，將上調(diào)和下調(diào)的顯著性差異表達進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，上調(diào)表達lncRNAs 38個，下調(diào)表達lncRNAs 35個。

右側(cè)點表示顯著上調(diào)的基因；左側(cè)點表示顯著下調(diào)的基因

以樣本為橫坐標、差異表達基因為縱坐標對差異顯著lncRNA進行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，2組樣本間lncRNAs表達差異顯著(P<0.05)，試驗組與對照組屬于不同的分支，說明這2組樣本所有基因的表達模式不同。

圖2 差異表達lncRNAs聚類熱圖

2.4 lncRNA靶基因富集分析

2.4.1 GO功能富集 將篩選出來的差異表達的lncRNA進行反式調(diào)控靶基因預(yù)測，利用GO數(shù)據(jù)庫進行分類，涉及生物過程(biological process,BF)510個條目、細胞組分(cellular component,CC)87個條目、分子功能(molecular function,MF)67個條目。生物過程包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)過程、防御反應(yīng)、生物刺激、病毒反應(yīng)和先天性免疫等；細胞組分大多富集在胞內(nèi)的細胞器和染色體等；分子功能主要富集在蛋白結(jié)合、ATP酶調(diào)節(jié)活性、陰離子結(jié)合和腺苷酸結(jié)合等。挑選顯著富集的前30個繪制氣泡圖，結(jié)果見圖3。

每個節(jié)點代表一個GO條目術(shù)語，代表富集到每個GO 條目中的差異基因；節(jié)點的大小與富集到該通路中的差異基因個數(shù)成正比

同時對GO富集結(jié)果前10個GO條目繪制網(wǎng)絡(luò)圖，其中，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)過程、多器官反應(yīng)、壓力應(yīng)答等過程富集基因最多，且靶基因存在一定的交叉，同時調(diào)控多種反應(yīng)過程，如STAT2參與病毒防御、病毒反應(yīng)和壓力應(yīng)答等過程，調(diào)控病毒感染后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；IL23R、TRAF3、TNFRSF4、IFNGR1等多種細胞因子相關(guān)受體被顯著富集到這些條目(圖4)。

圖4 GO功能富集網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 KEGG通路富集 選取顯著差異的前29條通路繪制柱狀圖(圖5)。結(jié)果顯示，841條靶基因共富集到332個信號通路上，大部分靶基因與細胞循環(huán)、疾病及免疫應(yīng)答有關(guān)，其中細胞循環(huán)差異最顯著，含127條靶基因，占15.1%，差異顯著性依次為p53信號通路、減數(shù)分裂等。

圖5 KEGG通路功能分析

進一步分析發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)(intestinal immune network for IgA production)、甲型H1N1流感(influenza A)等與免疫應(yīng)答反應(yīng)、細胞凋亡等過程有關(guān)，其中，Toll樣受體信號通路在這些通路中被顯著富集。

2.5 Toll樣受體信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

通過差異表達的lncRNA的KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)Toll樣受體通路顯著富集，該通路共富集到靶基因22個，包括RIPK1、NFKBIA、TRAF3、PIK3CD、LY96、CXCL11、SPP1、MAPK8、IRAK1、IRF7、TLR3、MAP2K6、PIK3CB、TICAM1、TLR1、TLR6、PIK3CA、CCL4、CXCL10、CXCL9、TOLLIP、IFNAR1。lncRNA-ENSSSCG00000041959、lncRNA-ENSSSCG000000 37324、lncRNA-ENSSSCG00000049925、lncRNA-ENSSSCG00000048079共4個lncRNA(后續(xù)簡寫為lncRNA959、lncRNA324、lncRNA925、lncRNA079)是與Toll樣受體信號通路相關(guān)的差異表達lncRNAs，具體信息見表4。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)多數(shù)靶基因與lncRNA959作用，lncRNA959位于6號染色體(P=0.00879)，預(yù)測出lncRNA959通過反式調(diào)控靶基因RIPK1、IRAK1的表達，兩者與lncRNA靶向調(diào)控的正確率分析高達0.97和0.99，初步鑒定出lncRNA959-RIPK1和lncRNA959-IRAK1可能是影響Toll樣受體信號通路的lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

表4 Toll樣受體信號通路靶基因

2.6 差異表達lncRNAs的驗證

為驗證測序結(jié)果中獲得的差異表達lncRNA結(jié)果的可靠性，對Toll樣受體信號通路富集到的4個主要基因進行實時熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA-seq與實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)基本一致(圖6)，說明測序結(jié)果較可靠。

圖6 4個差異表達lncRNAs的驗證

3 討 論

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，為該科唯一成員。該病毒是唯一的DNA蟲媒病毒，只感染豬，家豬和野豬尤為易感，感染后出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，包括持續(xù)高燒、厭食、水樣腹瀉、皮膚潮紅和運動失調(diào)等[13-15]。病理學(xué)上可見全身器官出血性病變，并伴有白細胞減少癥和細胞因子風(fēng)暴[16]。細胞因子在免疫反應(yīng)、抗病毒作用等方面有著關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)[17-18]。盡管目前對發(fā)病機理的認識不斷加深，但ASFV誘發(fā)這些變化的具體機制仍有待進一步研究。

新一代高通量測序技術(shù)近幾年得到快速發(fā)展并不斷優(yōu)化，在挖掘和鑒定lncRNA方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在生物活動和病理過程(如病毒感染和腫瘤發(fā)生)中發(fā)揮重要作用[19]，不僅對豬的各種性狀具有調(diào)控作用，而且可影響某些疾病的發(fā)生發(fā)展[12]，尤其是病毒宿主相互作用以及病毒增殖等過程[20]。Hao等[21]檢測乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)lncRNAs的血漿水平發(fā)現(xiàn)，AP000253能促進肝癌細胞系中HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并可作為HBV感染的潛在生物標志物。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)節(jié)抗病毒先天免疫反應(yīng)的lncRNA-Malat1，通過RNA-RBP互作網(wǎng)絡(luò)靶向TDP43激活來抑制抗病毒先天反應(yīng)，增加了對先天反應(yīng)和自身免疫發(fā)病機制的分子調(diào)控的認識。目前，有關(guān)ASFV感染后引起宿主mRNA和miRNA等差異表達譜已有報道，但ASFV感染后引起宿主lncRNA差異表達譜鮮有報道。根據(jù)先前的報道，急性ASF試驗性感染在接種后7～10 d出現(xiàn)臨床癥狀，可被視為感染晚期[10]。組織病理學(xué)評估顯示疾病發(fā)生典型改變，如巨噬細胞浸潤和細胞凋亡，以及ASF感染終末期的細胞因子風(fēng)暴[23]。同時，本研究在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)在3～5 d開始表現(xiàn)食欲下降等臨床癥狀，7 d左右出現(xiàn)運動障礙、食欲衰退和高熱等癥狀。因此，本試驗以ASFV感染7 d后的外周血淋巴細胞為研究對象，利用高通量測序技術(shù)成功構(gòu)建了豬外周血淋巴細胞的lncRNA文庫，去除低質(zhì)量、受污染序列及<25 bp的小片段后，共獲得Clean reads 504 387 798條，這些高質(zhì)量數(shù)據(jù)不僅豐富了豬的RNA文庫，同時為后續(xù)研究奠定了一定基礎(chǔ)。經(jīng)進一步統(tǒng)計學(xué)分析后得到73個差異表達lncRNAs，聚類熱圖顯示，2組樣本的基因表達量差別較大，存在明顯的上調(diào)、下調(diào)。

利用GO數(shù)據(jù)庫，將差異基因按照參與的生物過程、細胞組分、分子功能等分類富集分析，生物過程富集到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過程及先天性免疫，推測這些差異lncRNA可能通過模式識別受體識別特定病原體相關(guān)分子模式，啟動先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而誘導(dǎo)干擾素的表達。ASFV編碼多種免疫逃逸蛋白以逃避宿主天然免疫系統(tǒng)，如MGF360、MGF505能抑制Ⅰ型干擾素(IFN-I)表達，同時抑制產(chǎn)生的抗病毒效應(yīng)[24]。Jiang等[25]發(fā)現(xiàn)lnc-Lsm3b與病毒RNA競爭結(jié)合RIG-Ⅰ單體，限制RIG-Ⅰ蛋白的構(gòu)象變化，阻止下游信號傳導(dǎo)，從而終止IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。IFN-Ⅰ誘導(dǎo)的lncRNA-ISIR反饋通過去除免疫反應(yīng)中的抑制性Fli-1來增強IRF3的激活，揭示了lncRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子激活的調(diào)節(jié)方法[26]。對于本研究中篩選到的差異lncRNAs調(diào)節(jié)先天性免疫需進一步驗證。

差異表達lncRNAs靶基因的KEGG信號通路富集結(jié)果顯示,Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、甲型H1N1流感等通路顯著富集。TLRs對病原體的識別通過誘導(dǎo)促炎細胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的上調(diào)，引起先天免疫的快速激活。通過MyD88依賴性途徑進行TLR信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致促炎細胞因子的產(chǎn)生，并快速激活NF-κB和MAPK。Toll樣受體在ASF感染過程中也發(fā)揮著重要作用[27]。Henriques等[28]發(fā)現(xiàn)一種新的ASFV蛋白pI329L可抑制Toll樣受體3(TLR3)信號通路。ASFV編碼蛋白A528R通過靶向p65激活和核轉(zhuǎn)位抑制TLR8-NF-κB信號傳導(dǎo)。I329L抑制dsRNA刺激的NFκB和IRF3的激活，I329L蛋白的表達也抑制了IFN-β和CCL5的激活。TRIF的過度表達逆轉(zhuǎn)了I329L介導(dǎo)的NFκB和IRF3激活的抑制[29]。Yang等[30]在ASFV感染后的轉(zhuǎn)錄水平分析后發(fā)現(xiàn)，TLR4和TLR6是RLR途徑的負調(diào)節(jié)因子，在ASFV感染期間呈顯著下降趨勢，本研究在參與Toll樣受體信號通路的lncRNA靶基因中也發(fā)現(xiàn)了TLR1、TLR3、TLR6等因子，這表明ASFV感染可能激活了TLR和RLR信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)，ASFV感染會導(dǎo)致外周血淋巴細胞Toll樣受體信號通路顯著富集，結(jié)合前期報道及研究，ASFV可能通過調(diào)控Toll樣受體信號通路進而影響宿主免疫炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本試驗成功運用新一代高通量測序技術(shù)篩選出差異表達lncRNAs，并進行GO功能、KEGG通路富集分析，初步鑒定出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影響Toll樣受體信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。預(yù)測lncRNA-ENSSSCG00000041959通過反式調(diào)控靶基因RIPK1、IRAK1的表達進而影響Toll樣受體信號通路。