彭雪,吳煜,張曉娜*,陳萬浩,朱麗偉,陳慶富*,鄧嬌

蕎麥種子高萌發(fā)率蟲生真菌菌株的篩選

彭雪1,吳煜1,張曉娜1*,陳萬浩2,朱麗偉1,陳慶富1*,鄧嬌1

1. 貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心, 貴州 貴陽 550001 2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 菌物藥研究中心, 貴州 貴陽 550025

篩選促進(jìn)蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌株，為研究蟲生真菌對蕎麥的促生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，本文采用4種蟲生真菌16株菌株的芽孢子和分生孢子懸液以1×106個(gè)/mL的濃度浸種2個(gè)品種6個(gè)品系的蕎麥種子，獲得對蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌株。結(jié)果表明，16株蟲生真菌菌株均可提高蕎麥種子的萌發(fā)率、芽長和芽直徑長度，且對米苦蕎種子的促生作用大于甜蕎；多數(shù)分生孢子對萌發(fā)率、芽直徑的促生作用較芽孢子效果好，多數(shù)芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。

蕎麥; 種子萌發(fā); 蟲生真菌

蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（），約有23個(gè)物種，其中甜蕎（）和苦蕎（）是兩個(gè)主要的糧用栽培種。目前蕎麥的消費(fèi)產(chǎn)品主要以其種子加工后的食品為主，如饅頭、面包、面條、糕點(diǎn)[1]等食物，其富含的淀粉、黃酮類物質(zhì)、礦物質(zhì)等保健成分，具有“三降”（降血壓、降血糖、降血脂）、“三抗”（抗氧化、抗炎、抗癌）等功能[2-4]，使其成為集營養(yǎng)、醫(yī)療、保健為一體的重要糧藥兼用作物[5]。

種子萌發(fā)是預(yù)測后續(xù)植株發(fā)育和農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的關(guān)鍵階段。如何在保證安全的情況下既能提高其萌發(fā)率、出苗率，又能促進(jìn)其芽苗的生長，成為研究者關(guān)注最高的問題。目前，用于促進(jìn)蕎麥種子萌發(fā)的技術(shù)與方法主要有超聲波處理[6]、添加赤霉素、吲哚乙酸[7]等植物生長調(diào)節(jié)劑，使用硼肥溶液[8]，改變溫度和光照[9]，去果皮[10]等，但化學(xué)添加劑對生物和環(huán)境有一定的負(fù)面影響，其它方法耗時(shí)耗力且不能大規(guī)模有效的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，因此迫切需要尋找新的安全的生物技術(shù)來促進(jìn)種子萌發(fā)。

蟲生真菌(Entomopathogenic fungi)以其能夠寄生于昆蟲、蜘蛛等節(jié)肢動(dòng)物中致其死亡，又對人畜無危害、環(huán)境無污染[11]，且在自然狀態(tài)下或通過人工接種的方式（如葉面噴施、傷口涂抹、注射法、浸種法、根莖浸沒、種子包衣等）定殖于植物中，促進(jìn)植物生長、免受病蟲害侵?jǐn)_而備受青睞[12-15]。

因此，本文擬研究環(huán)鏈棒束孢、粉棒束孢、蝙蝠蛾擬青霉、玫煙色棒束孢4種蟲生真菌的16株菌株對米13、米18、米55、1412-16、貴甜2號(hào)、紅甜1號(hào)6個(gè)蕎麥品系種子的浸種實(shí)驗(yàn)，獲得對蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌種和菌株，探究蟲生真菌對蕎麥種子萌發(fā)的影響，以期為進(jìn)一步研究蟲生真菌與蕎麥的相互作用機(jī)制提供材料及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蕎麥品種：共2個(gè)品種6個(gè)品系，分別為米苦蕎（米13、米18、米55），甜蕎（貴甜2號(hào)、1412-16、紅甜1號(hào)），均由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供。

供試菌株：此試驗(yàn)中菌株1、6號(hào)為貴州中醫(yī)藥大學(xué)陳萬浩博士饋贈(zèng)，其他菌株均由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供（表1）。

表 1 供試蟲生真菌菌株

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理芽孢子懸液制備：在試管中挑取菌絲接種到150 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在150 r/min、25 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 d，用雙層擦鏡紙過濾菌懸液，獲得芽孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，測定孢子濃度，用無菌水將孢子懸液濃度稀釋至1×106個(gè)/mL。

分生孢子懸液制備：將供試菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d，待培養(yǎng)基上長滿菌落，用0.05%吐溫-80無菌水洗滌，并用雙層擦鏡紙過濾，獲得分生孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板測定孢子濃度，用0.05%吐溫-80無菌水將孢子懸液濃度稀釋至1×106個(gè)/mL。

1.2.2 消毒將選取的蕎麥種子進(jìn)行表面消毒，先用無菌水清洗1遍，再用70%的無水乙醇浸泡1 min，25%的次氯酸鈉表面消毒1 min，最后用無菌水清洗表面的次氯酸鈉殘留液，清洗3次，將最后一次清洗種子的無菌水取1滴進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)觀察5 d發(fā)現(xiàn)無菌長出，則為消毒成功。

1.2.3 浸種將每種蕎麥的30粒種子置于1.2.1中制備的15 mL孢子懸液中完全浸沒，于室溫下浸種2h，對照組分別用液體培養(yǎng)基和0.05%吐溫-80無菌水浸種，條件與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.2.4 培養(yǎng)將浸種后的種子以每種30粒，5顆/每行*6行的方式置于發(fā)芽盒（12×12 cm）中，3個(gè)重復(fù)，在溫度為25±1 ℃，相對濕度為70±5%，光照周期L:D=12:12的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，露白即視為萌發(fā)，每天記錄萌發(fā)數(shù)，第3 d用游標(biāo)卡尺測量其芽長和芽直徑。

1.3 數(shù)據(jù)分析

萌發(fā)率（%）=(萌發(fā)種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

萌發(fā)指數(shù)()=∑(/)，為第日的萌發(fā)種子數(shù)，為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)。

用Excel 2010進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖，SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)方法在0.05水平對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Tukey法在0.05水平對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子萌發(fā)率的影響

如表2、3、4、5、6、7所示，用16株蟲生真菌菌株的芽孢子、分生孢子懸液分別對米苦蕎和甜蕎進(jìn)行浸種后，種子萌發(fā)率隨時(shí)間的延長而增加，除貴甜2號(hào)與對照組無顯著性差異外，實(shí)驗(yàn)組的萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)均高于對照組，同一天同一菌株對比芽孢子、分生孢子懸液對米苦蕎種子萌發(fā)率結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異不顯著。

第3 d菌株4、7號(hào)芽孢子懸液和菌株13號(hào)分生孢子懸液浸種的米13種子萌發(fā)率最高，分別為96.67±3.33%和97.78±1.92%，分別是對照組的1.13倍和1.17倍（表2）；菌株1、5號(hào)的芽孢子和菌株12號(hào)分生孢子浸種的米18種子萌發(fā)率達(dá)100%，分別是對照組的1.07倍和1.09倍（表3）；菌株10號(hào)芽孢子懸液和菌株12號(hào)分生孢子懸液浸種的米55種子萌發(fā)率最高，分別為100.00±0.00%和98.89±1.92%，分別是對照組的1.11倍和1.21倍（表4）。

相較米苦蕎種子，甜蕎種子前3 d萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)均較低，其中菌株5號(hào)芽孢子懸液和菌株3號(hào)分生孢子懸液浸種的1412-16種子萌發(fā)率最高，分別為31.67±2.36%和35.00±2.36%，分別是對照組的14.27倍和15.77倍（表6）；菌株5號(hào)芽孢子懸液和菌株8號(hào)分生孢子懸液浸種的紅甜1號(hào)種子萌發(fā)率最高，分別為48.33±7.07%和56.67±4.72%，分別是對照組的3.63倍和3.64倍（表7）。

表 2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米13萌發(fā)率的影響

注：表中所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列不同小寫字母表示同列不同菌株之間差異顯著（<0.05），“*”表示同一天同一菌株分生孢子與芽孢子之間差異顯著（<0.05）。下同。

Note: The data are presented as the mean ± SE.The different lowercase letters in the same column present significant differences among the different strains in the same column at<0.05. “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at< 0.05. The same as follows.

2.2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽長的影響

如圖1所示，用16株蟲生真菌的孢子懸液浸種后，不同菌株、不同孢子懸液對不同品種種子芽長的影響不同，米苦蕎中，除菌株2號(hào)的芽孢子懸液和菌株5、9號(hào)分生孢子懸液外，其他菌株實(shí)驗(yàn)組芽長均高于對照組，其中菌株8號(hào)芽孢子懸液和菌株6號(hào)的分生孢子懸液對米13、米18的促生效果最好，菌株5號(hào)的芽孢子懸液和菌株6號(hào)的分生孢子懸液對米55芽長促生效果最好（圖1A、1B、1C）；相較米苦蕎，蟲生真菌對甜蕎種子芽長的促生效果較小，其中菌株15號(hào)、8號(hào)的芽孢子和菌株6號(hào)、7號(hào)、4號(hào)的分生孢子分別對紅甜1號(hào)、貴甜2號(hào)、1412-16的促生效果最好（圖1D、1E、1F）；芽孢子和分生孢子相較，除1412-16和貴甜2號(hào)，多數(shù)芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。

表 3 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米18萌發(fā)率的影響

表 4 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米55萌發(fā)率的影響

表 5 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對貴甜2號(hào)萌發(fā)率的影響

表 6 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對1412-16萌發(fā)率的影響

表 7 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對紅甜1號(hào)萌發(fā)率的影響

注：“*”表示同一菌株分生孢子與芽孢子差異顯著（?0.05）。

Note: “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at the< 0.05.

2.3 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽直徑的影響

如圖2所示，用16株蟲生真菌菌株的孢子懸液浸種后，不同菌株、不同孢子懸液對不同品種種子芽直徑的影響不同。米苦蕎中，多數(shù)菌株的分生孢子較芽孢子效果好，菌株1號(hào)的芽孢子和菌株9號(hào)的分生孢子對米13的芽直徑促生最快；菌株2號(hào)的芽孢子和菌株14、15號(hào)的分生孢子對米18的芽直徑促生最快；菌株1、2號(hào)的芽孢子和菌株16號(hào)的分生孢子對米55芽直徑促生最快（圖2A、2B、2C）。

相較米苦蕎，蟲生真菌對甜蕎芽直徑的作用較弱，但多數(shù)蟲生真菌對芽直徑有促進(jìn)作用，極少數(shù)（如2號(hào)、12號(hào)）不顯著，且多數(shù)分生孢子效果較芽孢子好，菌株9號(hào)的芽孢子懸液和菌株6號(hào)的分生孢子懸液對紅甜1號(hào)芽直徑促生最快；菌株5號(hào)的芽孢子懸液和菌株3號(hào)的分生孢子懸液對1412-16的芽直徑促生最快；菌株5號(hào)的芽孢子懸液和菌株7號(hào)的分生孢子懸液對貴甜2號(hào)的芽直徑促生最快（圖2D、2E、2F）。

圖 2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽直徑的影響

注：“*”表示同一菌株分生孢子與芽孢子差異顯著（?0.05）。

Note: “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at< 0.05.

3 結(jié)論與討論

蟲生真菌可通過浸種的方式定殖于植物促進(jìn)其生長。用球孢白僵菌孢子懸液浸種牛蒡，可促進(jìn)其生長[16]；用白僵菌、玫煙色棒束孢浸種大豆，可提高植株的株高和地上、地下部分的干鮮重[17]；用環(huán)鏈蟲草浸種番茄，對其生長有顯著促進(jìn)作用[18]；本文用環(huán)鏈棒束孢、粉棒束孢、蝙蝠蛾擬青霉、玫煙色棒束孢4個(gè)菌種的孢子懸液浸種蕎麥種子，不僅能夠提高蕎麥種子的萌發(fā)率，還可促進(jìn)芽長的生長，與前者研究相似，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了蟲生真菌的促生作用。

雖然蟲生真菌對作物有促生作用，但不同菌種、不同菌株、不同孢子懸液對不同作物品種的促生效果不同。Qayyum MA等的研究表明2株白僵菌可促進(jìn)番茄生長，1株白僵菌則表現(xiàn)出減少地上部分干重和果實(shí)重量的副作用[19]。本文中菌株9號(hào)分生孢子懸液浸種的種子萌發(fā)率、芽長、芽直徑都顯著低于對照組，其余大部分菌株均能不同程度的促進(jìn)種子萌發(fā)、芽長、芽直徑的生長。芽孢子與分生孢子懸液相比，多數(shù)分生孢子對萌發(fā)率、芽直徑促生作用較芽孢子效果好，多數(shù)芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。用不同蟲生真菌對甜蕎和米苦蕎進(jìn)行浸種后，米苦蕎全部萌發(fā)了，甜蕎種子并未全部萌發(fā)，這可能與蕎麥種子殼薄厚有關(guān)，以及菌株芽孢子和分生孢子所含碳水化合物的不同有關(guān)，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究首次證明了蟲生真菌對蕎麥種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，且篩選出菌株12號(hào)的分生孢子懸液對米55種子的萌發(fā)效果最好，這將為研究蟲生真菌促進(jìn)植物生長提供新的材料，為理解互作作用提供了新的思路。

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Screening of High Germination Rate Strains of Entomopathogenic Fungi against Buckwheat Seeds

PENG Xue1, WU Yu1, ZHANG Xiao-na1*, CHEN Wan-hao2, ZHU Li-wei1, CHEN Qing-fu1*, DENG Jiao1

1.550001,2.550025,

To provide a theoretical foundation for studying the mechanism by which entomopathogenic fungi promote buckwheat seed germination by screening the best entomopathogenic fungi strains. The submerged conidia and aerial conidia suspensions of 16 strains of 4 entomogenic fungi were used in the present study to infiltrate 6 varieties of 2 strains of buckwheat seeds at a concentration of 1×106conidia/mL, and the best entomogenic fungi strains with the best germination effect on buckwheat seeds were obtained. It was found that 16 entomopathogenic fungi strains could improve the germination rate, bud length, and bud diameter of buckwheat seeds, withseeds having a more significant effect on growth thanseeds. In general, aerial conidia exhibited a greater growth-promoting effect on germination rate and bud diameter than submerged conidia. However, most of the submerged conidia exhibited a greater growth-promoting effect on the buckwheat bud.

Buckwheat; seed germination; entomopathogenic fungi

S517

A

1000-2324(2022)03-0393-08

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.03.009

2022-04-15

2022-07-01

教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(黔教合KY字[2020]246);貴州師范大學(xué)資助博士科研項(xiàng)目(11904/0517052)

彭雪(1998-),女,在讀研究生,研究方向:害蟲生物防治研究及病原微生物利用. E-mail:2286839081@qq.com

Author for correspondence. E-mail:1263432172@qq.com; cqf1966@163.com.