郭亞蕓，史紅梅，丁杰，王顯蘇

（山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東濟(jì)南 250100）

葡萄蒸餾酒是以葡萄為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒[1]。高級(jí)醇是葡萄蒸餾酒中主要風(fēng)味物質(zhì)之一，其含量極大地影響著蒸餾酒的品質(zhì)及安全性。高級(jí)醇，又稱雜醇油，一般指具有3個(gè)及以上碳原子的一元醇[2]，是酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[3]。高級(jí)醇種類和含量對(duì)蒸餾酒的香氣特征和風(fēng)味起著決定性作用，適量的高級(jí)醇能夠使酒體醇甜、豐滿[3-4]。然而，高濃度的高級(jí)醇使蒸餾酒產(chǎn)生“異味”，飲用之后使人產(chǎn)生頭暈、頭痛的感覺(jué)，也就是通常所說(shuō)的“上頭”。此外，高級(jí)醇在人體內(nèi)的代謝比乙醇緩慢，過(guò)量累積也會(huì)導(dǎo)致肝損傷[5-6]，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害。葡萄蒸餾酒常見(jiàn)的高級(jí)醇有正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種。因此，對(duì)葡萄蒸餾酒中5種高級(jí)醇的精準(zhǔn)檢測(cè)和質(zhì)量控制顯得尤為重要。

《蒸餾酒及配制酒—衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》（GB/T 5009.48—2003）中推薦了分光光度法和填充柱氣相色譜法作為高級(jí)醇的檢測(cè)方法[7]。但兩種方法均有一定的缺陷，分光光度法試驗(yàn)操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，試驗(yàn)中顯色不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，準(zhǔn)確度不高[8]；填充柱氣相色譜法采用外標(biāo)定量法，進(jìn)樣技術(shù)的高低，直接影響著試驗(yàn)結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度。因此，本研究采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。與外標(biāo)法相比，該方法不受進(jìn)樣誤差制約，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

靜態(tài)頂空法是一種間接分析方法，應(yīng)用于揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質(zhì)的分析。與直接進(jìn)樣法相比，不存在儀器和色譜柱被污染的風(fēng)險(xiǎn)，還具有操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究采用靜態(tài)頂空/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時(shí)測(cè)定葡萄蒸餾酒中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級(jí)醇含量，旨在為葡萄蒸餾酒的產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津GCMS-QP2010 Ultra及工作站（日本島津），AOC-6000頂空進(jìn)樣器，電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），20 mL頂空瓶（瑞士CTC Analytics AG）。

氯化鈉和無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。正丙醇（99.5%）、異丁醇（99.5%）、正丁醇（99.7%）、異戊醇（99%）、正戊（99.5%）和叔戊醇（99.5%）均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。1#、2#、3#、4#、5#、6#葡萄蒸餾酒均為本試驗(yàn)室產(chǎn)品，酒精度分別為65%、60%、55%、65%、60% 、55% Vol。

1.2 GC-MS測(cè)定條件

GC條件：色譜柱為RTX-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 μm×0.25 mm）；載氣為高純氦氣；分流進(jìn)樣，分流比為50∶1，進(jìn)樣口溫度200 ℃；柱溫采用程序升溫：35 ℃保持5 min，再以18 ℃·min-1升至100 ℃，最后以25 ℃·min-1升至150 ℃，恒流模式，流量1.0 mL·min-1

MS條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃；電離模式：電子轟擊源（EI），轟擊能量70 eV。選擇離子監(jiān)測(cè)待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間、定量離子和定性離子（表1），以叔戊醇為內(nèi)標(biāo)物。

表1 選擇離子檢測(cè)叔戊醇和5種高級(jí)醇的保留時(shí)間、定量離子和定性離子Table 1 Values of retention time and quantitative and qualitative ions under SIM mode for tert-amyl alcohol and five high alcohols

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和模擬酒樣的配制

樣品空白基質(zhì)：用無(wú)水乙醇和超純水配制體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，作為樣品空白基質(zhì)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇各1.0000 g于100 mL容量瓶中，用樣品空白基質(zhì)溶解并定容，配成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存，備用。

模擬酒樣：由樣品空白基質(zhì)將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋而成。

1.4 頂空氣相色譜-質(zhì)譜法試驗(yàn)過(guò)程

取5.0 mL葡萄蒸餾酒樣（提前添加無(wú)水乙醇或稀釋成酒度60%）或模擬酒樣于20.0 mL頂空瓶中，加入0.5 g氯化鈉，5 μL叔戊醇作為內(nèi)標(biāo)物，用帶硅橡膠膠墊的具有磁力的瓶蓋封閉，放入自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤，頂空進(jìn)樣器設(shè)定轉(zhuǎn)速為250 r·min-1，在55 ℃下攪拌10 min，進(jìn)樣1000 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空條件優(yōu)化

2.1.1 頂空平衡溫度的優(yōu)化

在靜態(tài)頂空進(jìn)樣中，樣品的平衡溫度將直接影響試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)考察了平衡溫度分別為40、45、50、55、58 ℃下的目標(biāo)物峰面積的大小。結(jié)果表明，5種高級(jí)醇的峰面積隨溫度升高而增大，55 ℃時(shí)達(dá)到最大，然后峰面積隨溫度升高而減?。▓D1）。平衡溫度越高，5種高級(jí)醇的蒸氣壓越高，頂空氣體的濃度越高，峰面積越大；另一方面，過(guò)高的平衡溫度可能造成待測(cè)組分在傳輸管路中的冷凝，導(dǎo)致進(jìn)樣量變少，峰面積減小[10]，因此，最優(yōu)平衡溫度為55 ℃。

圖1 頂空平衡溫度的優(yōu)化Figure 1 Optimization of headspace equilibrium temperature

2.1.2 頂空平衡時(shí)間的優(yōu)化

在頂空過(guò)程中，平衡時(shí)間是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素。靜態(tài)頂空試驗(yàn)是在恒溫平衡狀態(tài)下，通過(guò)測(cè)定從樣品基質(zhì)揮發(fā)到頂空瓶上方的揮發(fā)性物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的。

本研究考察了平衡時(shí)間為5、10、15、20、30 min時(shí)對(duì)目標(biāo)物峰面積的大小的影響。結(jié)果表明：平衡時(shí)間為10 min時(shí)，5種高級(jí)醇的峰面積最大（圖2）。因此，適宜的平衡時(shí)間為10 min。

圖2 頂空平衡時(shí)間的優(yōu)化Figure 2 Optimization of headspace equilibrium time

2.1.3 NaCl添加量的優(yōu)化

靜態(tài)頂空法測(cè)定揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)，樣品基體以及電解質(zhì)的濃度可能影響活度系數(shù)，因此，適當(dāng)增加液體樣品的離子強(qiáng)度，產(chǎn)生“鹽效應(yīng)”，可降低5種高級(jí)醇在液體樣品中的溶解度，從而影響測(cè)定靈敏度[11]，增強(qiáng)目標(biāo)分析物的響應(yīng)值。通過(guò)考察0、0.5、1.0、1.5 g NaCl添加量，來(lái)討論鹽效應(yīng)對(duì)目標(biāo)分析物峰面積大小的影響。結(jié)果表明，當(dāng)添加0.5 g NaCl時(shí)，5種高級(jí)醇的峰面積最大，為最佳添加量，見(jiàn)圖3。

圖3 NaCl添加量的優(yōu)化Figure 3 Optimization of the amount of NaCl

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用樣品空白基質(zhì)配制目標(biāo)分析物濃度為0.08～10 g·L-1的模擬酒樣，添加5 μL 叔戊醇。按照1.4的試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)譜掃描方式為SIM模式，定性離子和定量離子的選擇由表1所示，叔戊醇為內(nèi)標(biāo)，繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程如表2所示。5種高級(jí)醇在0.08～10 g·L-1的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）在0.9994～0.9999。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得到正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級(jí)醇的檢出限在0.25～1.27 mg·L-1。

表2 五種高級(jí)醇的線性方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equation, inear range, r, limit of detection for five high alcohols

2.2.2 準(zhǔn)確度與精密度驗(yàn)證

為考察本研究建立的SH/GC-MS可行性和用于葡萄蒸餾酒中5種高級(jí)醇測(cè)定時(shí)的準(zhǔn)確度，對(duì)葡萄蒸餾酒進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。取3種自制的葡萄蒸餾酒（1#、2#、3#），在0.1、0.5、1 g·L-1添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)3次。結(jié)果表明：5種高級(jí)醇的添加回收率在80.0%～87.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝3）小于10%。該方法有較高的準(zhǔn)確度和良好的穩(wěn)定性，可用于葡萄蒸餾酒中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級(jí)醇的檢測(cè)。

表3 葡萄蒸餾酒中5種高級(jí)醇的測(cè)定(n=3)Table 3 Determination of five high alcohols in distilled wine (n=3)

2.3 實(shí)際樣品分析

以所建立的SH/GC-MS，對(duì)3種葡萄蒸餾酒（4#、5#、6#）中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級(jí)醇含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，高級(jí)醇總含量分別為1.8486、0.9542、2.1500 g·L-1，見(jiàn)表4。在所選擇3種葡萄蒸餾酒中，正丁醇、正戊醇均未檢測(cè)出，說(shuō)明這3種葡萄蒸餾酒中正丁醇和正戊醇的量低于該方法的檢測(cè)限。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2757—1981《蒸餾酒及配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》之前對(duì)于高級(jí)醇（以異丁醇和異戊醇計(jì)）含量要小于2 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)（按60%折算），4#、5#和6#樣品均符合要求。

表4 實(shí)際葡萄蒸餾酒樣品的測(cè)定Table 4 Determination of actual distilled wine samples g·L-1

3 討論與結(jié)論

在蒸餾酒中高級(jí)醇起著舉足輕重的作用，若含量過(guò)低，酒體不豐滿，口感差；但是含量過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響酒體的協(xié)調(diào)性，還會(huì)對(duì)飲用者的身體健康產(chǎn)生潛在的危害，比如宿醉和嚴(yán)重頭痛[12-13]。因此，建立準(zhǔn)確可靠的高級(jí)醇的檢測(cè)方法顯得尤為重要，在蒸餾酒質(zhì)量安全控制方面發(fā)揮的作用重大。

本試驗(yàn)所選毛細(xì)管柱與國(guó)標(biāo)中填充柱相比較，雖然填充柱出峰時(shí)間快，但分離效果較差[14]；而本研究選擇的毛細(xì)管柱，在質(zhì)譜掃描時(shí)用SIM方式，完全可以克服上述問(wèn)題，結(jié)果更加準(zhǔn)確。目前，有關(guān)運(yùn)用靜態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)葡萄蒸餾酒中高級(jí)醇的相關(guān)報(bào)道不多。莫燕霞等[15]采用毛細(xì)管內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白蘭地中高級(jí)醇含量，方法檢出限為2.5 mg·L-1；于洪梅[16]采用固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用法分析了啤酒中的5種高級(jí)醇，檢出限為2～7 mg·L-1；甄會(huì)英等用氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定葡萄酒中的高級(jí)醇，回收率為95.18%～102.25%；蘆麗等[18]采用靜態(tài)頂空氣相色譜法分析了保健酒中高級(jí)醇含量，檢出限為1.4～2.0 mg·L-1。

本文建立了靜態(tài)頂空與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)蒸餾酒中高級(jí)醇進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)頂空平衡溫度、頂空平衡時(shí)間和氯化鈉添加量等靜態(tài)頂空條件的優(yōu)化選擇，建立了操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，且不損傷儀器設(shè)備的分析方法，用于葡萄蒸餾酒中高級(jí)醇的檢測(cè)。正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級(jí)醇的檢出限為0.25～1.27 mg·L-1，加標(biāo)回收率80.0%～87.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，在實(shí)際樣品分析中具有良好的適用性。