周慧敏
(大連市檢驗檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心,遼寧大連 116630)
三聚氰胺,簡稱三胺,學(xué)名三氨三嗪,是一種氮雜環(huán)有機化工原料,廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣和醫(yī)藥等行業(yè)。由于具有毒性,不可用于食品加工或食品添加物[1]。三聚氰胺進入人體后難以代謝和排出,過量攝入三聚氰胺會促使體內(nèi)形成結(jié)石,從而誘發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病,甚至導(dǎo)致腎衰竭和死亡[2]。2008 年三聚氰胺事件后,三聚氰胺的檢測對乳品企業(yè)非常重要,是乳品企業(yè)質(zhì)量控制部門日常工作的重要監(jiān)測項目,也是各級市場監(jiān)督管理部門重點監(jiān)管項目[3]。嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg,高于上述限量的食品一律不得銷售。
目前三聚氰胺檢測一般采用國家推薦標(biāo)準(zhǔn)《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T 22388—2008)[4], 該 標(biāo) 準(zhǔn) 包 括 高 效 液 相 色 譜 法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用 法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)。GB/T 22388—2008 中HPLC、LC-MS/MS前處理均采用陽離子交換固相萃取柱凈化,基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法定量,方法操作煩瑣,檢測成本高。GC-MS(GC-MS/MS)采用陽離子交換固相萃取柱凈化后,進行硅烷化衍生,外標(biāo)法定量,前處理方法更加復(fù)雜。目前有文獻(xiàn)報道使用HPLC-外標(biāo)法進行定量分析,測定食品中含乳飲料的三聚氰胺非法添加劑的含量,但HPLC 方法相對于LC-MS/MS 靈敏度偏低,對低含量樣品不適宜[5]。
本方法采用LC-MS/MS,以三氯乙酸和甲醇作為萃取試劑,經(jīng)亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白后,用三聚氰胺13C3為內(nèi)標(biāo)進行測定。由于液體乳蛋白含量高,前處理過程中用蛋白沉淀劑取代了陽離子交換固相萃取柱凈化,簡化了實驗步驟,用三聚氰胺13C3為內(nèi)標(biāo)定量減少了基質(zhì)效應(yīng)對實驗結(jié)果的影響,與《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T 22388—2008)相比,本方法更為簡便,準(zhǔn)確度更高。
Agilent 6460 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent 公司);XW280A 旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司);Z 32HK 型高速離心機(德國HERMLE 公司)。
三氯乙酸(分析純,天津科密歐公司);亞鐵氰化鉀(分析純,天津科密歐公司);乙酸鋅(分析純,天津科密歐公司);乙酸(分析純,天津科密歐公司);乙酸銨(分析純,天津科密歐公司);乙腈(色譜純,天津科密歐公司);三聚氰胺(標(biāo)準(zhǔn)品,LGC 公司);三聚氰胺13C3(標(biāo)準(zhǔn)品,LGC 公司);微孔濾膜(13 mm 0.22 μm GHP,美國Waters 公司)。
三氯乙酸溶液:將10 g 三氯乙酸溶于1 000 mL水中,配制成1%的三氯乙酸溶液。
亞鐵氰化鉀溶液:稱取106 g 亞鐵氰化鉀,用水定容至1 000 mL,配制成92 g/L 的亞鐵氰化鉀溶液。
乙酸鋅溶液:稱取220 g 乙酸鋅酸,用水定容至1 000 mL,配制成183 g/L 的乙酸鋅溶液。
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液:稱取50 mg 三聚氰胺于50 mL 容量瓶中,50% 甲醇定容至刻度,得1 000 mg/L 的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。
三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)儲備液:稱取50 mg 三聚氰胺13C3于50 mL 容量瓶中,50%甲醇定容至刻度,得1 000 mg/L 的三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再用50%甲醇稀釋得到10 mg/L 的三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)中間液。
標(biāo)準(zhǔn)工作液:三聚氰胺、三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)儲備液用50%甲醇溶液逐級稀釋得到2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL的三聚氰胺以及20 ng/mL 的三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.1 樣品處理
稱取樣品約5 g 置于50 mL 帶刻度離心管中,分別加入10 mg/L 的三聚氰胺13C340.0 μL,旋渦混合使內(nèi)標(biāo)完全溶于樣品,再向樣品中分別加入7 mL三氯乙酸溶液、0.5 mL 亞鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 乙酸鋅溶液,用甲醇溶液定容至20 mL,旋渦混合2 min,10 000 r/min 離 心5 min, 過0.22 μm 濾 膜后收集于進樣瓶中,待上液質(zhì)聯(lián)用儀檢測,進樣量1 μL。
1.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線
分 別 取2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL 的三聚氰胺以及20 ng/mL的三聚氰胺13C3標(biāo)準(zhǔn)工作液,直接進樣,進樣量1 μL。
1.3.3 樣品測定
(1)色譜條件。色譜柱:Agilent Rx-SiL 4.6 mm×150 mm×5 μm;流動相乙酸銨溶液配制:準(zhǔn)確稱取0.385 g 乙酸銨,加入1 mL 乙酸,加水定容至500 mL;流動相:乙腈∶乙酸銨溶液=50 ∶50;流速:0.4 mL/min;柱溫:40 ℃。
(2)質(zhì)譜條件。電離方式:ESI+;監(jiān)測模式:MRM;離子源溫度:350 ℃;離子噴霧電壓:4 000V;各組分定性定量離子對等參數(shù)見表1。
表1 目標(biāo)組分質(zhì)譜檢測參數(shù)
先將目標(biāo)組分配制成1 000 ng/mL 的溶液,利用針泵進樣,找到母離子和子離子以確定MRM 離子對,優(yōu)化碰撞能,結(jié)果見表1。確定最優(yōu)質(zhì)譜檢測條件后進一步優(yōu)化液相色譜條件,采用安捷倫Rx-SiL (4.6 mm×150 mm, 5 μm)色譜柱,流動相為乙腈∶乙酸銨溶液=50 ∶50,流速為0.4 mL/min,柱溫為40 ℃。同時,選擇三聚氰胺13C3作為內(nèi)標(biāo)(添加濃度為20 ng/mL),能夠滿足大多數(shù)樣品的檢測。
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
以目標(biāo)物測定濃度為橫坐標(biāo),目標(biāo)物與對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo),繪制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線,在2.5 ~100.0 ng/mL 線性關(guān)系良好,回歸方程為y=0.998 266x+0.041 23,相關(guān)系數(shù)r為0.999 3,符合檢驗對標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。
2.2.2 方法定量限
選一空白樣品,按1.3.1 實驗步驟做加標(biāo)回收實驗,添加濃度從0.1 mg/kg 逐漸稀釋,當(dāng)添加水平至0.01 mg/kg 時,回收率均值為82.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.6%,滿足實驗要求,再降低添加濃度得到回收率均值,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不符合實驗要求。因此,確定0.01 mg/kg 為定量限。
分別向空白樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)工作液、同位素內(nèi)標(biāo)工作液,按照1.3.1 步驟處理并檢測。添加水平為0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3 個水平,每個濃度6 份平行樣本,檢測結(jié)果見表2。方法回收率為82.8%~102.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%~5.6%,回收率和精密度良好,符合檢測方法要求,適合液體乳中三聚氰胺的檢測。
表2 試樣回收率實驗結(jié)果
2.4.1 沉淀劑的選擇
亞鐵氰化鉀和乙酸鋅是實驗室常用的蛋白沉淀劑,在多個檢測標(biāo)準(zhǔn)中都有應(yīng)用,價格便宜容易獲得,是常用的前處理手段,凈化去除效果良好。在市場上采集20 份液體乳樣本按1.3.1 實驗步驟處理并檢測,在質(zhì)譜上均未發(fā)現(xiàn)有明顯干擾組分,因此本方法選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑進行沉淀凈化。
2.4.2 與標(biāo)準(zhǔn)方法對比
為比較本方法與國家推薦標(biāo)準(zhǔn)《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T 22388—2008)[4]的檢測結(jié)果的一致性,設(shè)計實驗如下。
向空白樣本中添加標(biāo)液,添加水平為0.04 mg/kg,分別采用GB/T 22388—2008 第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[4]和本方法進行檢測,每種方法測定6份平行樣本。GB/T 22388—2008 檢測結(jié)果平均值為0.035 mg/kg,本方法檢測結(jié)果平均值為0.037 mg/kg。實驗表明,兩種方法測定的結(jié)果無顯著性差異,本方法適合液體乳中三聚氰胺的檢測。
我國乳制品產(chǎn)量中,液體乳產(chǎn)量占比較大,達(dá)93.32%,其次為乳粉,占比達(dá)3.87%。乳制品檢測在各級抽查中占比較高,液體乳中的三聚氰胺的檢測更是監(jiān)管的重點。因此,尋找更加準(zhǔn)確、快捷的液體乳中三聚氰胺檢測方法對于節(jié)省成本、提高工作效率有著重要的意義。
本方法以三氯乙酸和甲醇作為萃取試劑,經(jīng)亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白,通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,采用電噴霧正離子化模式(ESI+)和多反應(yīng)檢測(MRM),以三聚氰胺13C3內(nèi)標(biāo)法測定液體乳中的三聚氰胺。結(jié)果表明,該方法可準(zhǔn)確測定液體乳中的三聚氰胺含量,且有很好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)大于0.99,定量限為0.01 mg/kg,加標(biāo)回收率在82.8%~102.3%,從而確認(rèn)本方法可準(zhǔn)確、快捷測定液體乳中的三聚氰胺。