廉 婧，張 超，華 悅，任天航，程世贊，蘇國(guó)明，史 輯,2*，賈天柱,2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600)

中藥飲片是中藥行業(yè)的三大支柱之一，是湯劑和中成藥的主要原料，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響到臨床用藥的安全性與有效性。就飲片而言，同種中藥材的產(chǎn)地與加工的差異、來(lái)源的不確定性和不穩(wěn)定性導(dǎo)致中藥飲片的外觀形態(tài)差異大，中藥飲片的批間、批內(nèi)質(zhì)量不均一。另外因各省炮制規(guī)范和用藥習(xí)慣不同，各地飲片形制也常有差異，中國(guó)藥典的炮制通則在切制項(xiàng)下，僅規(guī)定了片、塊、絲、段的厚度[1]，而對(duì)片形大小并未規(guī)定。因而，藥材的大小尺寸、質(zhì)地就成了影響飲片片形大小的主因，加上飲片的商業(yè)等級(jí)以大為優(yōu)的習(xí)俗，造成飲片片形大塊、大片盛行，人為增加了飲片加工和調(diào)劑的困難，直接影響臨床用藥療效的穩(wěn)定，更導(dǎo)致臨床科研數(shù)據(jù)重復(fù)性、可靠性不足，也制約了中藥飲片工業(yè)化生產(chǎn)的自動(dòng)化、智能化進(jìn)程。因此，迫切需要一種易于鑒定和檢測(cè)，可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備、規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量均一、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分揀，提高臨床用藥精準(zhǔn)性的新型飲片作為傳統(tǒng)中藥飲片的補(bǔ)充，以彌補(bǔ)其不足。

2015年，賈天柱教授[3]提出了微型飲片[2]的概念。微型飲片是指邊長(zhǎng)在0.5～1.0 cm左右的小薄片，具有高品質(zhì)、高流動(dòng)、高煎出的特性，可適應(yīng)飲片的智能生產(chǎn)、智能調(diào)劑和智能煎制，提高其生產(chǎn)效率和利用率。微型飲片以飲片的形制變革為外在形式，使飲片長(zhǎng)寬變小，片子變薄，片片均勻[4]，具有“規(guī)格劃一，流動(dòng)可調(diào)”特點(diǎn)的，且可滿足中醫(yī)臨床辨證施治需要的微型飲片具有重要意義。

羌活為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang或?qū)捜~羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的干燥根莖和根，羌活的NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang根莖較長(zhǎng)，藥材以根莖為主，油性足，氣清香，寬葉羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的根莖較短，藥材以根為主，油性差，氣弱，有膳濁氣，都具有解表散寒、祛風(fēng)除濕、止痛的功效，常用于風(fēng)寒感冒，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，風(fēng)濕痹痛，肩背酸痛等癥[5]，主產(chǎn)于四川、甘肅、青海等地[6]。羌活主要含揮發(fā)油及萜類(lèi)、香豆素類(lèi)、糖及糖苷類(lèi)、有機(jī)酸及酚類(lèi)、多炔類(lèi)等成分[7-8]，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗菌、抗癌細(xì)胞增殖等作用[9]。

以羌活為例，對(duì)不同形制規(guī)格的羌活飲片的干膏率，浸出物，有效成分含量等進(jìn)行測(cè)定，采用HPLC法建立指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析、多元統(tǒng)計(jì)分析以及多維化學(xué)分析，旨在為不同規(guī)格及產(chǎn)地的羌活微型飲片質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 E2695-2998型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 對(duì)照品綠原酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-13031401，純度>98%)，阿魏酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq19030705，純度>98%)，鐮葉芹二醇(批號(hào)B50624)、羌活醇(批號(hào)B20966)，阿魏酸苯乙醇(批號(hào)B27087)，紫花前胡苷(批號(hào)B21685)，異歐前胡素(批號(hào)B21546)(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。羌活共36批，采自甘肅禮縣、青海西寧、四川理縣，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang或?qū)捜~羌活NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.的干燥根莖和根。

2 方法

2.1 微型飲片切制 采用切片刀(刀刃長(zhǎng)度175 mm,寬度為45 mm)，刀刃角度大于65°，將3個(gè)產(chǎn)地藥材切制成不同規(guī)格微型飲片，編號(hào)S1～S36，以甘肅禮縣為例，見(jiàn)圖1，具體信息見(jiàn)表1。

圖1 羌活微型飲片(甘肅禮縣)Fig.1 Fine slices of Notopterygii Rhizoma et Radix(Lixian County,Gansu)

表1 羌活微型飲片信息Tab.1 Information for fine slices of Notopterygii Rhizoma et Radix

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 揮發(fā)油 取微型飲片粉末(過(guò)2號(hào)篩)約70.00 g(相當(dāng)于含揮發(fā)油0.5～1.0 mL)，精密稱(chēng)定，置于1 000 mL燒瓶中，加500 mL水與數(shù)粒碎瓷片，振搖混合后連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分至溢流入燒瓶，置于電熱套中緩緩加熱至沸，保持微沸約5 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開(kāi)啟測(cè)定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)零刻度線上面5 mm處，靜置3 h，再開(kāi)啟活塞使油層下降至其上端恰與零刻度線平齊，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算其含量。

2.2.2 異歐前胡素、羌活醇

2.2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)(44∶56)；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取微型飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.400 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取羌活醇、異歐前胡素對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.060、0.030 g/L溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取微型飲片(S1)6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取微型飲片(S17)6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1∶1比例加入對(duì)照品，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。

2.4 干膏率測(cè)定 精密稱(chēng)取微型飲片5 g，加10倍量冷水浸泡40 min，直火加熱，水沸后改用文火煎煮30 min，濾過(guò)，藥渣加8倍量水繼續(xù)煎煮，水沸后改用文火煎煮20 min，濾過(guò)，合并2次藥液，定容至100 mL量瓶中，混勻，精密量取煎液50 mL，置于恒重蒸發(fā)皿中，沸水浴濃縮至干，置于105 ℃烘干箱中烘至恒重，記錄煎膏質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

2.5 浸出物含量測(cè)定 取微型飲片約4 g，精密稱(chēng)定，置于250 mL錐形瓶中，精密加入乙醇100 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰并保持微沸1 h，放冷，取下錐形瓶，密塞，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，干燥濾器過(guò)濾，精密量取濾液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱(chēng)定質(zhì)量。以干燥品為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算浸出物含量。

2.6 HPLC指紋圖譜建立

2.6.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.3%乙酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，15%～26%A，10～20 min，26%～28%A，20～30 min，28%～35% A，30～60 min，35%～85%A，60～70 min，85%A)，體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.6.2 供試品溶液制備 取微型飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.4 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.6.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取綠原酸、紫花前胡苷、阿魏酸、羌活醇、異歐前胡素對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 0.296、0.433、0.373、0.500、0.412 g/L的溶液，即得。

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析、偏最小二乘判別分析。再采用層次分析法，采用Yaahp 10.3軟件將綜合評(píng)價(jià)設(shè)為決策目標(biāo)，將干膏率及浸出物、異歐前胡素、羌活醇含量設(shè)為方案層，分別給予權(quán)重系數(shù)，建立判斷矩陣，加權(quán)綜合評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1 各成分含量

3.1.1 揮發(fā)油 3個(gè)產(chǎn)地樣品揮發(fā)油得率分別為四川理縣2.14%、甘肅禮縣1.71%、青海西寧1.43%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的羌活揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于1.4%的要求。

3.1.2 羌活醇、異歐前胡素 將2種成分對(duì)照品溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知均在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships for various constituents

在精密度試驗(yàn)中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.08%，相對(duì)峰面積RSD<0.49%，表明儀器精密度良好。在穩(wěn)定性試驗(yàn)(24 h)中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.50%，相對(duì)峰面積RSD<0.64%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。在重復(fù)性試驗(yàn)中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3.00%，相對(duì)峰面積RSD<3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表4顯示，不同產(chǎn)地藥材中各成分含量差異較大，其中產(chǎn)地甘肅禮縣的S12樣品中羌活醇、異歐前胡素總含量較高，達(dá)到2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的3.43倍；產(chǎn)地青海西寧的S17樣品中兩者總含量最高，為藥典規(guī)定的3.52倍；但產(chǎn)地四川理縣僅S32樣品中兩者總含量符合藥典規(guī)定。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of recovery rates for various constituents (n=6)

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of various constituents

3.2 干膏率 見(jiàn)表5。

表5 出膏率測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results for determination of dry extract rate

3.3 浸出物含量 見(jiàn)表6。

表6 浸出物含量測(cè)定結(jié)果Tab.6 Results of content determination of leachate

圖2 36批樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for thirty-six batches of samples

5.綠原酸 10.紫花前胡苷 11.阿魏酸 15.羌活醇 16.阿魏酸苯乙醇酯 17.異歐前胡素5.chlorogenic acid 10.nodakenin 11.ferulic acid 15.notopterol 16.β-phenethyl ferulate 17.isoimperatorin圖3 對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 Reference chromatogram

3.4 HPLC指紋圖譜 36批樣品按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以S1為參照，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 s，指紋圖譜、對(duì)照?qǐng)D譜分別見(jiàn)圖2～3，共標(biāo)定18個(gè)共有峰。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)其中6種成分，分別為5號(hào)峰綠原酸、10號(hào)峰紫花前胡苷、11號(hào)峰阿魏酸、15號(hào)峰羌活醇、16號(hào)峰阿魏酸苯乙醇酯、17號(hào)峰異歐前胡素。由于10號(hào)峰分離度較好，峰面積大而穩(wěn)定，故以其為參照(S)，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.38%～2.37%，相對(duì)峰面積RSD為38.36%～236.98%，表明不同產(chǎn)地、規(guī)格樣品中各成分含量差異較大，相似度見(jiàn)表7。由此可知，各批樣品所含成分種類(lèi)整體上隨產(chǎn)地變化較大，其中四川理縣產(chǎn)者差異較大。

表7 36批樣品相似度Tab.7 Similarities of thirty-six batches of samples

3.5 聚類(lèi)分析 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，當(dāng)判別距離為25時(shí)，各批樣品聚為2類(lèi)，產(chǎn)地四川理縣(S25～S36)第1類(lèi)，產(chǎn)地甘肅禮縣(S1～S12)、青海西寧(S13～S24)為第2類(lèi)。

3.6 主成分分析 以36批樣品HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為變量，采用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析[10-14]，特征值、方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表8，碎石圖見(jiàn)圖5，初始因子荷載矩陣見(jiàn)表9。

圖4 36批樣品聚類(lèi)分析圖Fig.4 Cluster analysis plot for thirty-six batches of samples

表8 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.8 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

圖5 主成分分析碎石圖Fig.5 Scree plot for principal component analysis

表9 主成分初始因子載荷矩陣Tab.9 Loading matrices for initial factors of principal components

以R2X=0.807、Q2=0.168為標(biāo)準(zhǔn)繪制得分圖，見(jiàn)圖6。由此可知，產(chǎn)地甘肅禮縣(S1～S12)樣品分布于得分圖右側(cè)并較為集中，青海西寧(S12～S24)樣品分布于得分圖中央，四川理縣(S25～S36)樣品分布于得分圖左側(cè)，與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

圖6 主成分分析得分圖Fig.6 Score plot for principal component analysis

3.7 偏最小二乘判別分析 采用 SIMCA-P 13.0軟件對(duì)36批樣品進(jìn)行兩兩比較，得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖7，可知產(chǎn)地甘肅禮縣(S1～S12)與青海西寧(S13～S24)樣品各為一類(lèi)，甘肅禮縣(S1～S12)與四川理縣(S25～S36)樣品各為一類(lèi)，青海西寧(S13～S24)與四川理縣樣品(S25～S36)各為一類(lèi)。8個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志性成分(VIP>1)的VIP圖見(jiàn)圖8，其中8號(hào)峰不明(VIP=1.378 51)，10號(hào)峰為紫花前胡苷(VIP=1.337 45)，13號(hào)峰不明(VIP=1.284 45)，18號(hào)峰不明(VIP=1.212 24)，17號(hào)峰為異歐前胡素(VIP=1.193 17)，1號(hào)峰不明(VIP=1.189 15)，12號(hào)峰不明(VIP=1.121 13)，15號(hào)峰為羌活醇(VIP=1.064 27)。

圖7 偏最小二乘判別分析得分圖Fig.7 Score plots for partial least squares discriminant analysis

圖8 偏最小二乘判別分析VIP圖Fig.8 VIP diagram for partial least squares discriminant analysis

3.8 綜合評(píng)價(jià) 采用Yaahp 10.3軟件，以干膏率及浸出物、異歐前胡素、羌活醇含量為指標(biāo)，構(gòu)建層次分析法綜合評(píng)判體系進(jìn)行AHP量化評(píng)價(jià)，一致性比率CR=0.051 6<0.100，滿足一致性要求，結(jié)果見(jiàn)表10。由此可知，異歐前胡素、羌活醇含量占比79.57%，浸出物含量占比7.89%，干膏率占比12.53%，即微型飲片質(zhì)量主要由有效成分含量決定，其次是干膏率，最后是浸出物含量。

4 討論

含量測(cè)定中對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，比較不同流動(dòng)相(乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.3%乙酸)及不同的檢測(cè)波長(zhǎng)(246、310、325 nm)，柱溫(25、30、40 ℃)的影響，結(jié)果表明采用Agilent TC-C18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，柱溫為25 ℃時(shí)，各色譜峰的峰形較好，基本達(dá)到基線分離。

本研究采用 HPLC 法建立了 36批羌活微型飲片的指紋圖譜，標(biāo)定了18個(gè)共有峰，指認(rèn)其中6種成分。除產(chǎn)地四川的微型飲片編號(hào)為S24，其余

表10 36批樣品綜合得分Tab.10 Comprehensive scores for thirty-six batches of samples

樣品的相似度均>0.900，表明樣品中的化學(xué)成分具有較好的一致性。聚類(lèi)分析結(jié)果可知36批羌活微型飲片可分為2大類(lèi)，四川產(chǎn)羌活為一類(lèi)，甘肅青海產(chǎn)羌活為另一類(lèi)。主成分分析結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，甘肅產(chǎn)羌活不同形制規(guī)格以S12最佳，青海產(chǎn)羌活不同形制規(guī)格微型飲片以S17最佳，四川產(chǎn)羌活不同形制規(guī)格以S32最佳。不同形制規(guī)格羌活微型飲片的干膏率及浸出物的含量顯著高于常規(guī)飲片?？傮w來(lái)看，甘肅產(chǎn)羌活飲片質(zhì)量較好，不同形制規(guī)格微型飲片中，長(zhǎng)、寬均為0.5 cm的規(guī)格要優(yōu)于長(zhǎng)、寬均為1.0 cm的，長(zhǎng)、寬均為0.8 cm規(guī)格的次之，長(zhǎng)、寬均為1.2 cm的規(guī)格飲片含量最低。不同形制規(guī)格微型飲片的厚度為0.3 cm規(guī)格的質(zhì)量最佳，其次為厚度0.2 cm規(guī)格的，厚度為0.4 cm規(guī)格的質(zhì)量最差。甘肅產(chǎn)羌活以S12規(guī)格最優(yōu)，青海產(chǎn)羌活以S17規(guī)格最優(yōu)，四川產(chǎn)羌活的最優(yōu)規(guī)格是S32，其中S17與S32厚度均為0.3 cm。綜上羌活微型飲片的最優(yōu)規(guī)格為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm。

不同形制規(guī)格羌活飲片的質(zhì)量要優(yōu)于傳統(tǒng)飲片，粒徑越小越有利于有效成分的溶出，但是粒徑過(guò)小會(huì)導(dǎo)致飲片的完整率降低?？紤]到飲片廠的大工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況，長(zhǎng)、寬均為0.5 cm的規(guī)格較好；對(duì)于飲片的切制厚度上，通過(guò)從丁到薄片的比較，薄片的干膏率優(yōu)于丁。微型飲片以飲片的形制變革為外在形式，使飲片長(zhǎng)寬變小，片子變薄，片片均勻，結(jié)合現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制、工業(yè)自動(dòng)化、信息化等技術(shù)，將切實(shí)解決常規(guī)飲片到現(xiàn)代新型飲片的過(guò)渡問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)用藥各環(huán)節(jié)的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性，并可推動(dòng)中藥產(chǎn)業(yè)鏈從粗放型向集約型、從低效能向高效益快速轉(zhuǎn)變。