楊曉燕，雷 蕾，杜藝玫,4，秦 琳,4，張倩茹,4，何芋岐，鄭傳癡，周旭美

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003；3.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003；4.遵義醫(yī)科大學(xué)教育部藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003；5.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 遵義 563003)

清胰Ⅱ號(hào)顆粒臨床上用于治療急性胰腺炎或重癥急性胰腺炎。該方以大黃為君藥，配伍梔子、延胡索、木香、赤芍等藥材，具有利膽退黃、清熱解毒、活血化瘀等功效[1-2]。清胰Ⅱ號(hào)顆粒在保護(hù)胰腺細(xì)胞、保護(hù)腸黏膜、調(diào)節(jié)炎性因子等方面具有顯著活性[3-4]。為方便給藥并提高患者依從性，清胰Ⅱ號(hào)顆粒已被開(kāi)發(fā)成為復(fù)方顆粒制劑。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種由多病因誘導(dǎo)的胰腺局部及全身炎癥性疾病，病死率較高、并發(fā)癥較多，是消化系統(tǒng)危急重癥之一[5]。AP發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要有胰酶自身消化、炎性因子、膽源性胰腺炎等[6]，但機(jī)制尚不明確。膽汁淤積倒流引起的胰蛋白酶對(duì)胰腺組織的自身消化與AP發(fā)病直接相關(guān)[7-8]。膽汁酸是膽汁的重要組分，在AP發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。法尼醇受體(Farnesoid X receptor,FXR)是膽汁酸代謝通路的關(guān)鍵酶，可調(diào)節(jié)膽汁酸代謝通路上OATP、OSTα/β、NTCP等代謝酶的表達(dá)進(jìn)而控制膽固醇代謝成為膽汁酸[9-10]，維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)。研究表明，清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)急性胰腺炎的治療作用與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、調(diào)節(jié)膽汁酸平衡有關(guān)。研究清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)FXR介導(dǎo)的膽汁酸代謝通路的影響，分析關(guān)鍵的調(diào)控靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雌性KM昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK渝2012-0005，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑與藥物 大黃(批號(hào)150323)、梔子(批號(hào)150327)、延胡索(批號(hào)150323)、木香(批號(hào)150323)、赤芍(批號(hào)150327)、牡丹皮(批號(hào)150323)、厚樸(批號(hào)150323)、芒硝(批號(hào)150203)由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院楊建文教授鑒定為正品。清胰Ⅱ號(hào)顆粒根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的工藝制備。膽堿乙硫氨酸飼料(江蘇協(xié)同飼料有限公司)。醋酸奧曲肽注射液(北京諾華制藥有限公司)。引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；Trizol(北京索萊寶科技有限公司)；SYBR green(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 儀器 AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；Thermo微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立 40只小鼠分為4批，每批10只，分別給予無(wú)膽堿乙硫氨酸(CDE)飼料1、2、3、4 d，眼眶取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測(cè)血清淀粉酶水平，根據(jù)其變化及小鼠死亡率來(lái)對(duì)造模時(shí)間進(jìn)行篩選。

2.2 分組與給藥 105只小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，清胰Ⅱ號(hào)顆粒低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組，每組15只，除正常組外，其余各組小鼠按“2.1”項(xiàng)下方法造模，然后模型組立即處死。清胰Ⅱ號(hào)顆粒低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組立即停止飼喂CDE飼料，改為普通飼料。根據(jù)臨床治療時(shí)間，清胰Ⅱ號(hào)顆粒低、中、高劑量組分別按3.9、7.8、15.6 g/kg劑量給藥3 d，陽(yáng)性對(duì)照組給予醋酸奧曲肽(20 μg/kg)3 d，正常組、陰性對(duì)照組給予等體積生理鹽水3 d，并且陰性對(duì)照組不給予藥物治療，用于觀察急性胰腺炎發(fā)展。給藥3 d后，檢測(cè)小鼠血清淀粉酶水平，10%甲醛固定胰腺，HE染色觀察其病理變化，肝臟在-80 ℃下冷凍保存。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)膽汁酸通路關(guān)鍵蛋白編碼基因mRNA表達(dá) 取小鼠肝臟組織10～30 mg，Trizol法提取總RNA，取2 μL，采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值及RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以Gapdh為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃復(fù)性10 s，60 ℃退火45 s，循環(huán)39次，55 ℃延伸5 s，讀取樣本Ct值，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 造模時(shí)間 圖1顯示，給予CDE飼料后，模型組小鼠血清淀粉酶水平持續(xù)升高，3 d后更明顯(P<0.05，P<0.05)，表明造模成功，但繼續(xù)飼喂會(huì)導(dǎo)致小鼠大量死亡，故確定造模時(shí)間為3 d。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 造模時(shí)間對(duì)小鼠血清淀粉酶水平的影響

3.2 清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)小鼠血清淀粉酶水平的影響 圖2顯示，與模型組、陰性對(duì)照組比較，清胰Ⅱ號(hào)顆粒高、中、低劑量組小鼠血清淀粉酶水平降低(P<0.05)，但無(wú)明顯量效關(guān)系。

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，$P<0.05。圖2 清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)小鼠血清淀粉酶水平的影響

注：A為正常組，B為模型組，C為清胰Ⅱ號(hào)顆粒低劑量組(3.9 g/kg)，D為清胰Ⅱ號(hào)顆粒中劑量組(7.8 g/kg)，E為清胰Ⅱ號(hào)顆粒高劑量組(15.6 g/kg)，F(xiàn)為陽(yáng)性對(duì)照組，G為陰性對(duì)照組。圖3 各組小鼠胰腺組織病理變化

3.3 小鼠胰腺組織病理變化 圖3顯示，正常組小鼠未見(jiàn)胰腺腫大、變硬、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等胰腺炎癥狀；模型組小鼠胰腺組織出現(xiàn)大片凝固性壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清、出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；清胰Ⅱ號(hào)顆粒低、中劑量組小鼠可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽組織增生，而高劑量組小鼠胰腺組織水腫減輕，出血明顯改善，炎細(xì)胞浸潤(rùn)不顯著；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠炎癥、出血等癥狀得以改善；陰性對(duì)照組小鼠可見(jiàn)明顯出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞輪廓不清晰等病理變化。

3.4 聚類(lèi)分析 采用RT-PCR測(cè)定膽汁酸通路上46個(gè)關(guān)鍵蛋白編碼基因mRNA表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，可知清胰Ⅱ號(hào)顆粒高劑量組與正常組聚為一類(lèi)，清胰Ⅱ號(hào)顆粒中、低劑量組聚為一類(lèi)并與清胰Ⅱ號(hào)顆粒高劑量組、正常組共聚為一類(lèi)，陰性對(duì)照組與模型組聚為一類(lèi)。由此表明，小鼠給予高劑量清胰Ⅱ號(hào)顆粒后，其膽汁酸通路的整體基因輪廓可回調(diào)至近正常狀態(tài)，而中、低劑量組作用不顯著；與模型組比較，陰性對(duì)照組小鼠膽汁酸通路基因輪廓未明顯改善。

3.5 主成分分析 圖5A顯示，陰性對(duì)照組與正常組在圖上分布于不同的象限，表明急性胰腺炎小鼠在膽汁酸代謝通路的基因調(diào)控上有顯著變化；不同劑量清胰Ⅱ號(hào)顆粒干預(yù)后，對(duì)上述變化均表現(xiàn)出一定回調(diào)，并且與正常組在得分圖上重合。圖5B顯示，Mapk1對(duì)組間區(qū)分貢獻(xiàn)最大，即為受清胰Ⅱ號(hào)顆粒復(fù)方顆粒影響最明顯的基因。另外，雖然Slco1a1在聚類(lèi)分析中表現(xiàn)出較大變化，但主成分分析表明它對(duì)組間區(qū)分的貢獻(xiàn)明顯弱于Mapk1。

注：白色表示上調(diào)，灰色表示下調(diào)，黑色代表無(wú)明顯變化。圖4 清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)小鼠膽汁酸通路基因表達(dá)調(diào)控的聚類(lèi)分析圖

圖5 清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)小鼠膽汁酸通路基因表達(dá)調(diào)控的主成分分析圖

圖6 清胰Ⅱ號(hào)顆粒對(duì)Mapk1、Slcola1基因表達(dá)的調(diào)控作用

3.6 基因表達(dá)分析 圖6顯示，Mapk1、Slco1a1基因表達(dá)調(diào)控與清胰Ⅱ號(hào)顆粒療效呈正相關(guān)，前者在模型組中顯著上調(diào)，在陰性對(duì)照組中無(wú)回調(diào)，而在清胰Ⅱ號(hào)顆粒高、中、低劑量組中顯著下調(diào)；后者在模型組、陰性對(duì)照組中顯著上調(diào)，在清胰Ⅱ號(hào)顆粒高劑量組中顯著下調(diào)。由此表明，Mapk1、Slco1a1可能是胰腺炎發(fā)病及治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用CDE飼料誘導(dǎo)小鼠急性胰腺炎，給予不同劑量的清胰Ⅱ號(hào)顆粒，通過(guò)測(cè)定血清淀粉酶并結(jié)合病理觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清胰Ⅱ號(hào)顆粒可顯著改善胰腺病理情況、降低血清淀粉酶、改善胰腺出血、減少單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞滲出。

胰腺炎患者胰腺組織廣泛壞死后，其血清淀粉酶水平可能與正常水平持平甚至更低，檢測(cè)結(jié)果易受其他因素影響而出現(xiàn)誤差[12]。當(dāng)急性胰腺炎發(fā)病后，血清淀粉酶可上升，但在3 d后血清淀粉酶的水平也會(huì)逐漸降低[13]，本實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出相應(yīng)的趨勢(shì)，陰性對(duì)照組的AMS低于正常組。因此，為避免實(shí)驗(yàn)誤差，采用AMS、病理切片對(duì)清胰Ⅱ號(hào)顆粒的藥理作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

膽汁的分泌、吸收、代謝受到疾病因素、不良飲食習(xí)慣等影響[14]，膽道中的膽汁酸和膽固醇嚴(yán)重失衡，造成膽固醇在膽管沉積形成結(jié)石[15]而滯留于膽道系統(tǒng)。持續(xù)的膽結(jié)石累積或膽結(jié)石摩擦導(dǎo)致胰膽管共同解剖通路堵塞，膽汁及胰液流入十二指腸的過(guò)程受阻[7]。膽汁酸等消化液返流回胰腺，激活的胰酶原對(duì)胰腺自身組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行消化，從而導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)生[8]。清胰Ⅱ號(hào)顆粒給藥之后，小鼠膽汁酸通路的Mapk1和Slco1a1顯著下調(diào)。

Mapk1是一組能被內(nèi)源性物質(zhì)激活的蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。在膽汁酸代謝通路(圖7)中，Mapk1信號(hào)通路是通過(guò)腸道調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)的重要途徑，在胰腺炎中起到重要的作用[16]。肝臟合成的膽汁酸會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至膽管，通過(guò)膽管進(jìn)入小腸，在小腸內(nèi)激活腸道FXR，腸道FXR上調(diào)腸上皮成纖維細(xì)胞因子(Fibroblast growth factors,FGF15)的表達(dá)[17]，而后者會(huì)隨著門(mén)靜脈血流進(jìn)入肝臟并轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Mapk1表達(dá)進(jìn)而抑制Cyp7a1和Cyp8b1的表達(dá)[18]，抑制膽固醇代謝為膽汁酸。Slco1a1是動(dòng)物及人體內(nèi)重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)了膽汁酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[19]，膽汁酸是OATP1的配體，F(xiàn)XR可以抑制OATP1表達(dá)減少膽汁酸的吸收[20]。

圖7 膽汁酸通路的肝腸循環(huán)(KEGG map04976)

基于胰腺炎與膽汁酸通路的關(guān)系探討清胰Ⅱ號(hào)顆粒的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)清胰Ⅱ號(hào)顆粒能顯著下調(diào)Mapk1并上調(diào)Cyp7a1和Cyp8b1，促進(jìn)膽固醇分解代謝為膽汁酸，同時(shí)下調(diào)Slco1a1，減少膽汁酸的吸收，使膽汁酸通路恢復(fù)平衡，避免膽結(jié)石的形成堵塞胰膽管，最終改善胰腺炎癥狀。

清胰Ⅱ號(hào)顆粒高劑量給藥時(shí)可明顯減輕胰腺炎的癥狀，可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟和血液循環(huán)之間的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)而實(shí)現(xiàn)[21]。但長(zhǎng)期、大劑量的使用可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，易導(dǎo)致消化道不良反應(yīng)[22]。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)表明清胰Ⅱ號(hào)顆粒無(wú)消化道的功能性損害，說(shuō)明該制劑具有安全性[23]。

綜上所述，清胰Ⅱ號(hào)顆粒治療急性胰腺炎的潛在機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控膽汁酸通路來(lái)調(diào)節(jié)膽固醇代謝以及膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)，促使膽汁酸通路恢復(fù)平衡。