張 敏，華 樺，曾安琪，劉 俐，劉 芳，趙軍寧,

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院轉(zhuǎn)化藥理與臨床應(yīng)用研究所，四川省中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心，四川省道地藥材形成原理與品質(zhì)評價工程研究中心，中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點(diǎn)研究室，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)，四川 成都 610041)

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升并愈發(fā)年輕化[1-4]。乳房并非維持生命的重要器官，但乳腺癌細(xì)胞易失去細(xì)胞間的黏附能力，極易增殖擴(kuò)散，短時間內(nèi)迅速轉(zhuǎn)移、生長到其他器官如骨髓、淋巴等，最后危及患者生命[5-8]。姜黃素類為中藥姜黃的主要有效成分，目前已有研究證實姜黃素能抑制膀胱癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的生長[9-10]。四氫姜黃素 (tetrahydrocurcumin)為姜黃素在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤作用[11-14]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究探索了四氫姜黃素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制，為四氫姜黃素后續(xù)開發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)由上海中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供，目錄號TCHu74。

1.2 試劑與藥物 四氫姜黃素由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥學(xué)研究所提供，批號2018090，純度≥98%。二甲基亞砜(DMSO)(批號EZ6688D182)購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(批號8119244)購自美國Gibco公司；胎牛血清(批號1909505)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶(批號14J22C67)購自美國HyClone公司；細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK8，批號14I07A60)、HRP-羊抗兔IgG(批號BST14KBL54)、HRP-羊抗小鼠IgG(批號BST14J0A50)均購自武漢博士德生物工程有限公司；結(jié)晶紫染色液(批號C0121)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號20200624)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；β-肌動蛋白(β-Actin)(批號HL0305)購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)(批號GR3204084-11)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)(批號GR3244972-1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)(批號GR3219584-4)、BCL-2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)(批號GR380247-20)均購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 BSC-1304ⅡA2細(xì)胞生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；美國311水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；1820型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ME204/02電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；YM100 A滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；C2500低溫離心機(jī)(湖南湘儀實驗儀器廠)；090-135008倒置顯微鏡(德國徠卡公司)。

2 方法

2.1 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 CCK8實驗 將對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用完全培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,以每孔8 000、6 000、4 000個細(xì)胞接種于3塊96孔板中，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁至80%～90%時，加入不同濃度(0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)四氫姜黃素藥液進(jìn)行干預(yù)，每孔100 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL后，再避光加入10 μL CCK8溶液，37 ℃ 孵育1 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率，Graphpad計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞增殖存活率=[(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)]×100%。

2.1.2 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸后計數(shù)，細(xì)胞以500/mL密度分別加入6孔板中，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入濃度為0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L四氫姜黃素藥液，每3天換1次藥液至第10天。實驗結(jié)束時棄去舊培養(yǎng)基，加入1 mL甲醇固定15 min后棄去甲醇，再加入2 mL結(jié)晶紫避光固定30 min，結(jié)晶紫回收后PBS清洗孔板2次后晾干拍照。

2.2 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 MCF-7細(xì)胞形態(tài)變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞計數(shù)后，按1×105/mL密度接種于6孔板，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入濃度為0、25、50、100 μmol/L四氫姜黃素藥液，分別于0、48 h在200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞凋亡情況 用不含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，500 μL預(yù)冷Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium lodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.3 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

2.3.1 劃痕實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液密度調(diào)為5×105/mL后接種于6孔板，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行劃痕；將0、25、50、100 μmol/L四氫姜黃素藥液(含2%血清的培養(yǎng)基配制)依次加入孔板中，每孔2 mL，放入放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h后棄去舊液，用PBS清洗2次，再加入600 μL PBS，40倍顯微鏡下觀察拍照。Image J 軟件分析細(xì)胞遷移距離。

2.3.2 Transwell實驗 在對數(shù)生長期細(xì)胞中加入無血清培養(yǎng)基計數(shù)后調(diào)整密度為4×104/μL；用無血清培養(yǎng)基分別配置0、25、50、100 μmol/L四氫姜黃素藥液，每孔加入50 μL藥液和50 μL細(xì)胞懸液；將5個Transwell小室放入6孔板中，小室下加入600 μL含血清培養(yǎng)基，小室中加入50 μL無血清藥液和50 μL無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h后，棄小室下方培養(yǎng)基，用棉簽輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭小室，1 mL甲醇固定后，每孔加入1 mL結(jié)晶紫染液染色，用PBS清洗3次后用棉簽輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭小室中液體，于通風(fēng)櫥中晾干，將小室底部圓片取出放在滴有中性樹膠(滴載玻片中心)的載玻片上，蓋上蓋玻片，于100倍顯微鏡下拍照。

2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實驗 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待貼壁后加入相應(yīng)濃度的四氫姜黃素藥液(0、25、50、100 μmol/L)，48 h后用刮刀將各組細(xì)胞收集于離心管中，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰浴30 min后，加入等量4×SDS Loading buffer，進(jìn)行凝膠電泳后，置于轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后，加封閉液封閉1 h，用一抗(Bcl-2、Bax、MMP2、MMP9)孵育(4 ℃)過夜，放置于搖床用TBST清洗4次，15 min更換1次TBST，二抗孵育(37 ℃)1 h，發(fā)光液曝光10 min，顯影，進(jìn)行Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)分析。

3 結(jié)果

3.1 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

3.1.1 CCK8實驗 如圖1所示，實驗各時間點(diǎn)四氫姜黃素 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L劑量組細(xì)胞存活率，與空白對照組(0 μmol/L)比較均降低(P<0.05，P<0.01)。根據(jù)其IC50值提示后續(xù)試驗藥物作用濃度為0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L，實驗時間為48 h。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

3.1.2 克隆形成實驗 如圖2所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素25、50、100 μmol/L劑量組MCF-7細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.01)，四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞具有抑制作用。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，**P<0.01。圖2 四氫姜黃素對MCF-7克隆形成的影響

3.2 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

3.2.1 細(xì)胞形態(tài) 如圖3所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素作用48 h后細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，大量細(xì)胞碎片漂浮于培養(yǎng)液表面。

圖3 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

3.2.2 流式細(xì)胞術(shù)實驗 如圖4所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素50、100 μmol/L劑量組MCF-7細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05，P<0.01)，四氫姜黃素能促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

3.3 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

3.3.1 劃痕實驗 如圖5所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素25、50、100 μmol/L劑量組細(xì)胞遷移率降低(P<0.01)。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，**P<0.01。圖5 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞遷移的影響

3.3.2 Transwell實驗 如圖6所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素25、50、100 μmol/L劑量組穿透小室隔膜到達(dá)上層小室的底面的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，**P<0.01。圖6 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞遷移的影響

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，*P<0.05。圖7 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3.4 Western blot實驗 如圖7所示，與空白對照組比較，四氫姜黃素100 μmol/L劑量組MCF-7細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，提示四氫姜黃素能促進(jìn)MCF-7的凋亡。如圖8所示，四氫姜黃素100 μmol/L劑量組MCF-7細(xì)胞MMP2、MMP-9蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，表示四氫姜黃素能抑制MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

注：與空白對照組(0 μmol/L)組比較，*P<0.05。圖8 四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響

4 討論

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和致死率高，具有起病隱匿、發(fā)展快、早期診斷率低等特征，嚴(yán)重危害女性健康。腫瘤的轉(zhuǎn)移依靠癌細(xì)胞的遷移和侵襲兩大關(guān)鍵途徑，阻斷這些途徑是抗腫瘤治療的重要方法，因此，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增殖是預(yù)防和治療惡性腫瘤的重要研究方向[11]。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤的治療中通過穩(wěn)定癌灶、減輕放化療副作用及改善患者預(yù)后等多種方式起到良好抗腫瘤效果[15]。腫瘤的遷移與侵襲是腫瘤向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和增殖的第一步,腫瘤細(xì)胞必須要穿透細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜組成的組織屏障才能完成轉(zhuǎn)移[16-17]。MMP-9以酶原的形式分泌,被激活后形成Ⅳ型膠原酶,通過降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠,然后腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤,最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18-20]。MMP-2是金屬蛋白酶家族中與腫瘤關(guān)系最為密切的因子之一。MMP-2是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶,由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞以酶原形式分泌,經(jīng)水解后激活,能特異性地降解基底膜的主要成分—Ⅳ型膠原,還可降解Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ型膠原、FN和明膠,同時通過對細(xì)胞外基質(zhì)的改建,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,從而影響預(yù)后[18-23]。

本研究中，CCK8與克隆實驗結(jié)果顯示四氫姜黃素對MCF-7細(xì)胞的增殖具有抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)實驗及Western blot實驗結(jié)果顯示，四氫姜黃素能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；劃痕實驗、Transwell實驗及Western blot實驗結(jié)果表明四氫姜黃素能抑制細(xì)胞的遷移。綜上所述，四氫姜黃素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用，可促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞MMP2、MMP9的表達(dá)從而抑制MCF-7細(xì)胞遷移。本研究為四氫姜黃素在預(yù)防和/或治療乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了實驗依據(jù)，具有進(jìn)一步研究的價值。