陳晶 昌圖縣疾病預防控制中心 （遼寧 鐵嶺 112500）

內容提要： 目的：探討研究酶聯免疫反應加速儀在HIV抗體篩查試驗ELISA法中的應用。方法：選取2019年1月～2019年12月在本中心對艾滋病自愿咨詢檢測的521例人員采集靜脈血進行研究，在ELISA法試驗中分別酶聯免疫反應加速儀和水浴法，以此來探討酶聯免疫反應加速儀在HIV檢測中的作用；并以梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）檢驗結果作為金標準，分析ELISA法在HIV抗體篩查中的效果。結果：本研究結果顯示，酶聯免疫反應加速儀的靈敏度高于傳統(tǒng)水浴法，并且檢測時間也短于傳統(tǒng)水浴法（P＜0.05）。加速儀法的檢出率與水浴法完全一致（P＞0.05）。ELISA檢測結果與TPPA結果相比較，準確率為98.84%、靈敏度為85.71%、特異度為99.80%。結論：ELISA法在HIV抗體篩查中準確性較高，且酶聯免疫反應加速儀與水浴法能達到一致的檢驗效果，但是前者大幅度縮短ELISA檢測時間，提高了檢測靈敏度，提升了工作效率。

艾滋病全稱" 獲得性免疫缺陷綜合征"，是由人類免疫缺陷病毒引起的一種傳染病。患者免疫力極度下降，由此引起一系列的感染、腫瘤等惡性病變，甚至導致患者的死亡[1]。艾滋病的潛伏期長，且在發(fā)病之前沒有明顯癥狀特點，因此患者的治療時間往往比較偏后，對患者的生命健康安全造成巨大傷害。另一方面，艾滋病在目前尚無可以完全治愈的手段，因此艾滋病的預防與診斷就顯得十分重要。隨著艾滋病感染人數的逐年增多，各個縣級醫(yī)院也逐步建立起HIV抗體初篩實驗室，目前在進行入院檢查與輸血前檢查的必檢項目就是HIV抗體篩查，這項艱巨而繁重的工作則由HIV抗體初篩實驗室開展[2]。梅毒抗體檢測中梅毒螺旋體明膠凝集試驗（Treponema Pallidum Particle Assay，TPPA）是金標準，有著較高的特異性、敏感度，有利于非特異性抗體陰性或潛伏期患者診斷，但是TPPA試驗反應需要較長的時間，而且檢驗費用相對較高，不能對結果做自動化判斷，所以普及推廣受限。ELISA法因為其較為敏感而作為一種初篩方法被初篩實驗室首先選用，但是兩步法同樣會延長檢測的時間，工作人員的檢測效率也會因此受到不一樣的影響。本中心對一臺酶聯免疫反應加速儀進行引進并將它用于HIV抗體初篩實驗中，此儀器能夠廣泛應用在加速酶聯免疫反應。其是利用免疫反應中抗原、抗體結合部分形成互補,凹腔內氨基酸側鍵的位置有利于產生多種次級鍵，同時有序施加的高頻電磁波能促使離子遷移以及偶極子轉動使得免疫分子振轉的原理,進而使酶聯免疫反應時間由原本得幾十分鐘甚至數小時縮短至十分鐘內完成。為此，選取2019年1月～2019年12月在本中心對艾滋病自愿咨詢檢測的521例人員采集靜脈血進行研究，將其在使用過程中的檢測結果與影響進行分析，具體報告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

樣品：①隨機選取2019年1月～2019年12月在本中心對艾滋病自愿咨詢檢測的521例人員為研究對象，采集每位研究對象的靜脈血血清樣本進行試驗，其中男性體檢者353例、女性體檢者168例，年齡18～65歲，平均（42.65±7.52）歲。②質控品A和質控品B，由英科新創(chuàng)醫(yī)藥集團有限責任公司提供。

試劑材料：HIV（1+2）型抗體篩查試劑盒，專門用作HIV檢測篩查。

儀器材料：NY/MMJ型酶聯免疫反應加速儀用于抗體初篩檢查；HH-6恒溫水浴箱，用于傳統(tǒng)水浴法的抗體初篩檢測中；KHB科華洗板機；KC-100凱特酶標儀。

1.2 方法

按試劑盒說明書對水浴法進行能夠嚴格操作步驟：①將樣本加入37 C水浴箱后靜置反應60min；②將酶標抗原加入37 C水浴箱后靜置反應30min；③等待37 C水浴箱顯色30min。

酶聯免疫反應加速儀（加速儀法）用酶聯免疫反應加速儀取代水浴法中的37 C水浴箱，每一步的反應時間都有很大的不同。

用生理鹽水對質控品進行呈倍比的稀釋，再對兩種實驗方式進行敏感度的對比。

TPPA檢測方法：在U型培養(yǎng)板上對待測血清作稀釋，產生4種稀釋液，比例分別為1:10、1:20、1:40、1:80，在后兩種稀釋血清中加入未致敏和致敏明膠顆粒，放置2h。陽性標準：U形孔中顆粒呈大環(huán)，有外周凝集現象，外緣多形粗糙。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究中計量資料和計數資料均通過統(tǒng)計學軟件SPSS22.0進行分析，計量資料表示為±s、計數資料表示為n、%，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 檢測結果統(tǒng)計

檢測結果顯示：酶聯免疫反應加速儀法的第一、第二、第三步的反應時間分別為30min、20min、30min，沒有與操作說明書的水浴法有明顯差異，而其余的反應時間較傳統(tǒng)水浴法相比較短；且酶聯免疫反應加速儀的檢測結果顯示加速儀法的靈敏度比水浴法高。

2.2 兩種方法檢出率比較

結果顯示加速儀法的檢出率與水浴法完全一致（P＞0.05），見表1。

表1.加速儀法與水浴法對521份血清樣本檢測結果的統(tǒng)計分析(n)

2.3 ELISA法與TPPA法的診斷效能比較

結果顯示：經TPPA檢測出7例抗HIV（+）、514例抗HIV（-），陽性率為1.36%（7/521）。ELISA檢測出HIV（+）6例、抗HIV（-）515例，陽性率為1.16%（6/521）。以TPPA結果為金標準，ELISA檢測的準確率為98.84%（515/521）、靈敏度為85.71%（6/7）、特異度為99.80%（514/515），見表2。

表2.ELISA法與TPPA法的診斷效能比較(n)

3.討論

艾滋病能夠持續(xù)對人體的免疫系統(tǒng)造成破壞，最后導致患者的死亡，是一種全球性的重大傳染病，艾滋病有極高的病死率與傳染性。正是由于艾滋病具有病死率高與傳染性強的特點，目前艾滋病已經不完全是醫(yī)學上所要面臨的問題，更是對社會發(fā)展的危害。艾滋病的持續(xù)傳播與增長已經對社會和諧穩(wěn)定造成了威脅，成為一個嚴重的社會問題現象，需要各界人群對艾滋病有一個詳細認知與高度重視[3]。尤其是在我國當前的發(fā)展階段，由于國內文化與國外文化的發(fā)展，沖擊傳統(tǒng)觀念，致使人們的性觀念逐漸開放，從而使艾滋病更加快速的傳播，艾滋病在日常生活中的影響也越來越嚴重[4]。由于艾滋病對人體免疫系統(tǒng)的破壞，患者會出現各種罕見的感染性疾病與惡性腫瘤的發(fā)病。目前艾滋病還沒有完全有效的治療藥物與治療方案，當感染上艾滋病以后，醫(yī)護人員也只能通過高效抗病毒藥物來對艾滋病病情進行控制緩解，從而讓患者的生命得到延長[5]。在這樣的情況下，及時的預防與檢測艾滋病患病情況就顯得尤為重要。

在臨床上早期診斷HIV病毒感染中采取血清抗體檢測，伴隨近幾年醫(yī)療技術及生物學等多學科持續(xù)深入研究，經分子生物學能夠予以檢驗，可見雙抗夾心酶聯免疫法、化學發(fā)光法以及快速金標法等。其中酶聯免疫法和膠體硒法屬于臨床較為多見的檢查方法。酶聯免疫法則是利用酶催化放大作用來提供抗原抗體反應特異性以及敏感性，其對于檢驗環(huán)境、檢驗儀器以及操作人員的技術水平要求較高，且需要嚴格的標準以及操作流程，且需要花費較長的檢查時間。膠體硒法屬于一種快速檢查方法，該方法是經利用膠體硒標記和免疫層析相結合，隨后快速固相免疫分析技術對樣本血液中HIV抗體予以檢測，在此方法中整個檢查流程不需要使用任何儀器，具有操作簡單的特點，但此種方法的環(huán)境溫度要求較高，需要保持在25 C左右，若溫度較低，則會導致反應較慢，極易產生假陽性。

隨著克隆技術的不斷完善與發(fā)展，ELISA方法更多的應用于臨床診斷與醫(yī)學研究當中，提供了更加準確的數據用于許多疾病的預防、診斷、治療過程中。ELISA法是以酶聯免疫吸附測定法與雙抗原夾心法為原理，以梅毒免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M和IgG混合體為檢查對象，重組梅毒螺旋體，讓其在血清中有較高的純度，所以靈敏度和特異度均較高，可以一次性檢測多個樣本，再以酶標儀為依據，對檢測結果進行判斷。ELISA的操作對于臨床試驗的比重也越來越大，增加了許多工作量[6]。所以現在科研人員將目光放在如何將ELISA反應的實驗時間縮短、使檢測結果的準確性更高等方面，這是目前許多科研人員探討的重點。酶聯免疫反應加速儀利用免疫結合反應中的抗原抗體結合部分作為相互補充，各種次級鍵能夠在凹腔內氨基酸側鍵位置迅速得到產生，同時能夠將偶極子轉動與離子遷移帶起免疫分子震動的原理進行有效利用，有效的增加反應體系內抗原抗體分子濃度，解除靜態(tài)條件下的擴散受限因素，同時震動可使形成的熱氣流能夠使整個板孔有均勻的受熱效果，使檢測結果的穩(wěn)定性得到提高[7]。在ELISA的反應過程中，由于反應是通過微量反應板的圓柱形小孔中進行，試劑能夠擁有的固定面較大且靠近穩(wěn)定的固相面，所以有可能造成液相中的配體分子缺失減少，從而導致整個抗原抗體不能順利到達胞核，這就是限制擴散的原因；同時因為微量反應板上的反應孔是以長方形排列的順序，表現為四個角的孔乃至四周比中間的孔顯色深，這就是臨床醫(yī)學中的邊緣效應[8]。

本研究結果顯示：酶聯免疫反應加速儀法在HIV抗體初篩實驗中，第一步反應30min，第二步反應20min為最好的反應時間，顯色反應的30min不能進行縮減，這可能是由于在顯色反應過程中，抗原抗體不能進行結合，進行反應的只有酶分解底物仍為30min[9]。在抗體初篩檢測結果中，兩者的檢測結果與傳統(tǒng)水浴法相一致，并且酶聯免疫反應加速儀法的靈敏度更高[10]。另外，在本次研究中將TPPA結果為金標準，經計算ELISA法結果準確率為98.84%、靈敏度為85.71%、特異度為99.80%。充分說明，在HIV抗體篩查中ELISA法準確性較高，而且酶聯免疫反應加速儀與水浴法能取得相同水平的試驗結果；但是在操作方面，酶聯免疫反應加速儀能縮短ELISA檢測時間，提升了工作效率。不過本次研究中，有1例TPPA抗HIV（+）患者經ELISA法檢查為抗HIV（－），1例TPPA抗HIV（－）患者經ELISA法檢查為抗HIV（+），經過分析主要是因為梅毒特異性抗體具有“顯現早、消失晚”的特點，結果為陽性僅能表明，受檢者受到過梅毒螺旋體感染或正在感染，不能將其作為最終診斷結果[11]；比如患者已經進行了治療，還是會發(fā)現特異性抗體，所以ELISA檢測呈陽性，這就出現了誤診情況。因此，ELISA法是首選的HIV初步篩查方法，為了明確診斷建議多種診斷方法綜合判斷。

綜上所述，在確定各步反應最佳時間的情況下，酶聯免疫反應加速儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴法進行HIV抗體篩選實驗的ELISA法實驗中，能夠使抗原抗體的靈敏度增加，減少檢測的時間，能夠在提高靈敏度的同時也讓檢測的時間縮短，增加檢測效率，有效的判讀檢測結果，讓檢測的工作效率得到大幅提高。