董 劍，許小華

（聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院檢驗(yàn)科，廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000）

0 引言

乙型肝炎也被稱為乙肝，是目前世界上最常見(jiàn)的一類傳染病，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)[1]，在全世界范圍每年至少有100萬(wàn)以上的患者死于乙肝。慢性乙肝攜帶者大約占世界總?cè)丝诘?0%以上，而超過(guò)20%的急性乙肝患者會(huì)轉(zhuǎn)為慢性乙肝，隨著病情進(jìn)展逐漸發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，因此早期準(zhǔn)確判別乙肝對(duì)患者的預(yù)后尤為重要[2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)乙肝病毒DNA（HBV-DNA）是一種能夠早期診斷乙肝、能夠獲得準(zhǔn)確性較高的檢測(cè)結(jié)果并可進(jìn)行量化的檢測(cè)方法。在利用熒光定量PCR儀檢測(cè)HBV-DNA前，往往需要對(duì)臨床標(biāo)本提取樣本DNA。目前，實(shí)驗(yàn)室較常用的提取樣本DNA的方法為手工提?。ㄖ蠓蟹ǎ┖秃怂崛詣?dòng)提取儀提?。ù胖榉ǎ?。本研究在相同的檢測(cè)試劑和核酸擴(kuò)增儀的實(shí)驗(yàn)條件下利用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法分別提取樣本DNA，并進(jìn)行性能驗(yàn)證得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而選擇更合適HBVDNA的核酸提取系統(tǒng)，達(dá)到優(yōu)化HBV-DNA檢測(cè)流程的目的。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選擇2018年1—9月在我院檢驗(yàn)科分子生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的臨床樣本血清。所有臨床標(biāo)本均在空腹?fàn)顟B(tài)抽取靜脈血3～5 ml于真空采血管中，3 000 r/min離心10 min分離血清，4～8℃放置12 h待測(cè)。

1.2 儀器試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用美國(guó)ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific公司），檢測(cè)試劑用乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)?，中山達(dá)安基因）。全自動(dòng)核酸提取儀采用中山達(dá)安基因公司生產(chǎn)的smart 32型全自動(dòng)核酸提取儀。手工法提取核酸試劑采用中山達(dá)安公司的DNA提取液；全自動(dòng)核酸提取儀法提取核酸試劑采用中山達(dá)安公司的核酸提取或純化試劑盒。

1.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)

（1）反應(yīng)體系：50 μl。

（2）ABI7500核酸擴(kuò)增儀上反應(yīng)參數(shù)：93℃2min；93 ℃45 s，55 ℃60 s，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)收集的臨床樣本同時(shí)采用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法提取樣本DNA，依據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》，對(duì)采用以上2種方法提取的HBVDNA分別進(jìn)行批內(nèi)精密度、批間精密度、正確度、線性范圍驗(yàn)證。對(duì)2種方法的性能驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比較。本文中所有實(shí)驗(yàn)操作均依照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行[3]。

2.1 批內(nèi)精密度

收集臨床濃度為2.43×106copies/ml的高值血清樣本和濃度為2.81×103copies/ml的低值血清樣本。高值血清、低值血清樣本由同一操作人員分別利用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法各提取樣本DNA 10份（共計(jì)40份），上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果取對(duì)數(shù)，分別計(jì)算高值血清和低值血清利用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法的批內(nèi)精密度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 批間精密度

采用本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的達(dá)安公司生產(chǎn)的高值（強(qiáng)陽(yáng)性）質(zhì)控血清，濃度為 2.21×106copies/ml，批號(hào)為2017006，每個(gè)工作日分別用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法提取DNA后，上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)值。采用2018年9月1—30日的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（共計(jì)21個(gè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)）。對(duì)檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)值，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2.3 正確度

分別利用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法檢測(cè)可溯源的標(biāo)準(zhǔn)品4份（中山達(dá)安，批號(hào)20180404），每份標(biāo)準(zhǔn)品分別用不同的核酸提取方法提取3次DNA，然后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果取均值。分別計(jì)算偏倚：偏倚%=（測(cè)量值-理論值）/理論值×100%[4]。偏倚小于±7.5%，表示滿足臨床需求，可以接受[5]。對(duì)檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)值，然后進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2.4 線性范圍

取一份高值血清，濃度為2.43×108copies/ml，將此樣本的濃度當(dāng)作100%。再用正常人血清（乙肝陰性）分別按不同濃度稀釋為 2.43×107、2.43×106、2.43×105、2.43×104、2.43×103、2.43×102copies/ml，每份血清提取HBV-DNA后重復(fù)測(cè)定3次，取均值。將實(shí)際測(cè)量均值的對(duì)數(shù)值設(shè)為X，稀釋血清濃度預(yù)測(cè)值的對(duì)數(shù)值設(shè)為Y，作線性回歸分析[6]。得出回歸方程Y=bX+a，相關(guān)系數(shù)為R2。相關(guān)系數(shù)R2越接近1，說(shuō)明相關(guān)性越好。

2.5 臨床樣本結(jié)果比對(duì)

選取40個(gè)樣本（需覆蓋分析測(cè)量范圍），分別用手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法提取DNA，然后上機(jī)檢測(cè)HBV-DNA濃度，結(jié)果取對(duì)數(shù)，計(jì)算偏倚，并進(jìn)行直線回歸分析。其偏倚應(yīng)＜±7.5%。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 批內(nèi)精密度

分別比較核酸全自動(dòng)提取儀法和手工法的臨床樣本高值和低值血清，核酸全自動(dòng)提取儀法批內(nèi)精密度較手工法變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）更小，其批內(nèi)精密度更好。對(duì)以上2種方法提取高、低值血清HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)的批內(nèi)精密度結(jié)果分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.001，說(shuō)明2種方法批內(nèi)精密度的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果（n=40）

3.2 批間精密度

手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法的CV值分別為3.29%、2.84%，P＜0.001，2種方法批間精密度的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從測(cè)定結(jié)果可以看出全自動(dòng)核酸提取儀法較手工法CV值更小，其批間精密度更好。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法高值質(zhì)控品批間精密度驗(yàn)證結(jié)果（n=21）

3.3 正確度

手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)值后偏倚均小于±7.5%，其中核酸全自動(dòng)提取儀法偏倚比手工法更小，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 手工法和核酸全自動(dòng)提取儀法正確度驗(yàn)證結(jié)果

3.4 線性范圍

全自動(dòng)核酸提取儀法回歸方程為Y=1.048X-0.281 7，R2=0.985 8；手工法回歸方程為Y=1.020X-0.043 4，R2=0.966 0，對(duì)2種方法的相關(guān)系數(shù)分別做t檢驗(yàn)，P均＜0.01，說(shuō)明兩者在濃度為 2.43×102～2.43×108copies/ml的范圍內(nèi)線性較好，能滿足臨床需求。具體結(jié)果如圖1、2所示。

圖2 手工法線性分析圖

3.5 臨床樣本結(jié)果比對(duì)

分別用手工法和全自動(dòng)核酸提取儀法檢測(cè)40份臨床樣本（覆蓋分析測(cè)量范圍），其偏倚均小于±7.5%，相關(guān)性好，回歸方程為Y=1.019 9X+0.045 7，R2=0.912 7。對(duì)2種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.01，說(shuō)明2種方法檢測(cè)結(jié)果有顯著的相關(guān)性。具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 全自動(dòng)核酸提取儀法和手工法檢測(cè)40份臨床樣本相關(guān)線性分析

4 討論

從本研究的結(jié)果可以看出，全自動(dòng)核酸提取儀法高值和低值血清的批內(nèi)精密度（CV）分別為1.78%和2.44%，手工法高值和低值血清的批內(nèi)精密度（CV）分別為2.18%和3.76%；用高值質(zhì)控品分別做全自動(dòng)核酸提取儀法和手工法的批間精密度（CV），結(jié)果分別為2.84%和3.29%；分別用2.0×103、2.0×104、2.0×105、2.0×106copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行2種方法的正確度驗(yàn)證，全自動(dòng)核酸提取儀法的偏倚分別為-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%，手工法的偏倚分別為-4.88%、-2.51%、-2.46%、-2.12%。全自動(dòng)核酸提取儀法的批內(nèi)和批間精密度與手工法相比，CV值更小，其正確度平均偏倚也均小于手工法。其原因可能是由于不同的實(shí)驗(yàn)人員操作習(xí)慣和熟練程度的不同，導(dǎo)致提取DNA的效率也不同。全自動(dòng)核酸提取儀法提取DNA中途無(wú)需人工操作，可以避免由于人員的操作而帶來(lái)的結(jié)果的偏差。對(duì)2種方法的線性范圍分析和臨床比對(duì)實(shí)驗(yàn)可以看出，全自動(dòng)核酸提取儀法和手工法在較寬的線性范圍內(nèi)均有良好的線性，能夠滿足臨床實(shí)驗(yàn)的要求，二者實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的相關(guān)性。

全自動(dòng)核酸提取儀法提取DNA的原理是磁珠法，其利用磁性硅膠對(duì)DNA進(jìn)行特異性吸附，在磁場(chǎng)的作用下分離并獲取DNA，實(shí)驗(yàn)中無(wú)需離心和有機(jī)溶劑的使用。手工法提取DNA需要先用沉淀的方法去除蛋白質(zhì)，然后利用高速離心、加熱裂解等方法提取DNA，其實(shí)驗(yàn)步驟較多，實(shí)驗(yàn)過(guò)程也難以做到標(biāo)準(zhǔn)化。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出采用全自動(dòng)核酸提取儀法提取DNA，其批內(nèi)精密度和批間精密度均較手工法更好，其重復(fù)性更好。

全自動(dòng)核酸提取儀法提取核酸需要使用全自動(dòng)核酸提取儀以及相應(yīng)的提取試劑和配套耗材，而手工法提取核酸無(wú)需特殊儀器，耗材的成本也低于全自動(dòng)核酸提取儀法，全自動(dòng)核酸提取儀法提取核酸成本要高于手工法提取核酸。但手工法提取核酸每一步加樣本血清和試劑均需手工加入，增加了操作過(guò)程中樣本間交叉污染的可能性。本實(shí)驗(yàn)中所使用的smart 32型全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸中途無(wú)需手工操作，對(duì)于各樣本均有獨(dú)立的一次性耗材，從而可以避免操作過(guò)程中人為錯(cuò)誤以及樣本間交叉污染的問(wèn)題。該型全自動(dòng)核酸提取儀一次可以提取48份血清樣本，提取時(shí)間約30 min，可以很好地滿足小、中型實(shí)驗(yàn)室的需求；而手工法提取48份血清樣本，耗時(shí)約50 min?？傮w來(lái)說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)中全自動(dòng)核酸提取儀法提取DNA成本比手工法成本高1～2倍，平均耗時(shí)節(jié)約20 min左右，同時(shí)可以很好地節(jié)約實(shí)驗(yàn)室的人力資源。

總體來(lái)說(shuō)，從檢測(cè)可重復(fù)性、靈敏度、提取效率等方面考慮，全自動(dòng)核酸提取儀法提取HBV-DNA要優(yōu)于手工法。HBV-DNA檢測(cè)相較于其他的乙肝相關(guān)性檢測(cè)有窗口期短、特異性好等特點(diǎn)，其動(dòng)態(tài)變化又可作為抗病毒療效檢測(cè)以及抗藥性是否形成的重要指標(biāo)[7]。本實(shí)驗(yàn)中所使用的smart 32型全自動(dòng)核酸提取儀為國(guó)產(chǎn)儀器，相較于進(jìn)口儀器來(lái)說(shuō)，其具有降低醫(yī)院運(yùn)營(yíng)成本和推動(dòng)分級(jí)診療的優(yōu)勢(shì)[8]。醫(yī)療設(shè)備目前正向著小型化、便攜化的方向發(fā)展[9]，與生化和免疫實(shí)驗(yàn)室相比，分子生物實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化程度較落后，全自動(dòng)核酸提取儀法提取HBV-DNA有利于簡(jiǎn)化DNA提取流程，有利于分子生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取核酸。