王風(fēng)青，冉光雨

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

引 言

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是谷氨酸通過(guò)α-氨基與γ-羧基之間形成γ-酰胺鍵連接而成的高分子聚合物，其相對(duì)分子量為100～1000 kD[1-2]。γ-PGA 有3 種化學(xué)立體結(jié)構(gòu)：D-谷氨酸組成的均聚物γ-(D)-PGA、L-谷氨酸組成的均聚物γ-(L)-PGA 以及D-型與L-型谷氨酸按不同比例組成的γ-(D,L)-PGA[3-4]。純品γ-PGA 的紫外吸收峰在216 nm 處，不同于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰280 nm 處[5]。楊革等[6]發(fā)現(xiàn)γ-PGA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的80%是β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。由于γ-PGA 主鏈上存在大量的游離親水性羧基，使得γ-PGA 分子內(nèi)或分子間會(huì)形成水分子與谷氨酸殘基的氫鍵，從而讓聚合物具有優(yōu)異的吸水保濕性能[7]。γ-PGA 的一些活性部位為某些材料的功能化實(shí)現(xiàn)給予了結(jié)合位點(diǎn)，因此在生理學(xué)上，可以通過(guò)添加γ-PGA 來(lái)防止細(xì)胞被蛋白酶降解并阻止細(xì)胞脫水[8]。

γ-PGA 與其他高聚物材料相比在綠色環(huán)保方面具有諸多優(yōu)勢(shì)，讓其在眾多領(lǐng)域得到應(yīng)用。γ-PGA 可在環(huán)保領(lǐng)域中使用，作為重金屬離子和放輻射性物質(zhì)的契合劑[9]；添加鈣離子可減少γ-PGA的用量[10]；陽(yáng)離子型γ-PGA 絮凝劑和氯化鐵復(fù)配改性，可以高效去除海水中總懸浮固體與化學(xué)需氧量[11]；王芳等[12]利用SY-Z5 巨大芽孢桿菌產(chǎn)生的生物絮凝劑與SY-ND 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的γ-PGA 復(fù)配能夠有效去除焦化廢水中65%的懸浮物。在食品領(lǐng)域，γ-PGA 能夠有效改善面制品耐凍性質(zhì)、韌性和耐壓性[13-14]；也可用于增強(qiáng)葡萄的抗凍性[15]，還可以用于保護(hù)果汁中的雙歧桿菌細(xì)胞，從而使其存活率提高[16]；γ-PGA 完全水解后補(bǔ)充人體所需谷氨酸并增加食欲，同時(shí)也可以作為食品的增稠劑和除澀劑[17]。γ-PGA在應(yīng)用于化妝品中能促進(jìn)組織修復(fù)和細(xì)胞生長(zhǎng)[18]；且γ-PGA 制成的化妝品具有良好的抗菌活性、提高皮膚免疫力、撫平肌膚細(xì)紋[19]以及改善發(fā)質(zhì)[20]等作用。γ-PGA在醫(yī)療領(lǐng)域可用作手術(shù)縫線和醫(yī)用繃帶等[21]；γ-PGA 還能提高藥物的耐久性和藥物的有效性，控制藥物釋放速率[22]；γ-PGA靶向性可以通過(guò)糖基修飾得到增強(qiáng)且不會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生積蓄和毒副作用[23]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，γ-PGA 的使用能顯著提高種子的出苗率[24]，還可作為農(nóng)藥、肥料的緩釋劑[25]；γ-PGA制成的吸水樹脂，可以有改善土壤特性和保濕性[26]；γ-PGA作為種子的理想包衣，從而提高種子的發(fā)芽率[27]。

基于此，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定較優(yōu)因素，然后將較優(yōu)因素利用Minitab19 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)找到最大γ-PGA 產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件，從而試圖解決γ-PGA生產(chǎn)過(guò)程中原材料消耗高、γ-PGA產(chǎn)量低的問(wèn)題，這對(duì)γ-PGA的工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

1 試驗(yàn)方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 是由實(shí)驗(yàn)室分離冷藏的菌種；氯化鈉（AR），成都金山化學(xué)試劑有限公司；牛肉浸粉（AR），北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；無(wú)水氯化鈣（AR），西格瑪奧得里奇貿(mào)易有限公司；蛋白胨（生化試劑），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；α-耐高溫淀粉酶（生化試劑），酷爾化學(xué)科技有限公司；糖化酶（生化試劑），酷爾化學(xué)科技有限公司；谷氨酸鈉（食品級(jí)），上海太太樂(lè)食品有限公司；磷酸氫二鉀（K2HPO4，AR），成都市科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉（AR），成都市科隆化學(xué)品有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，AR），上海麥克林生化科技有限公司；糊精（AR），成都市科隆化學(xué)品有限公司；玉米粉，市售；蔗糖（AR），成都市科隆化學(xué)品有限公司。

鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A），上海助藍(lán)儀器科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（H10-50BS），天津宏諾儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（DY04-13-44-00），上海東亞壓力容器制造有限公司；氣浴振蕩器（THZ-A），上海助藍(lán)儀器科技有限公司；電子天平（FA2004N），杭州萬(wàn)特電子儀器有限公司；生物潔凈工作臺(tái)（BCM-1000A），蘇州安泰空氣科技有限公司；電子天平（WT2002），杭州萬(wàn)特衡器有限公司；萬(wàn)用電爐（DL-1），北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；立式透明門冷藏柜（SC-240JA），青島海爾特種電冰柜有限公；pH 計(jì)（pHS-3E），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；落地振蕩搖床（HZ-9610KB），太倉(cāng)市華利達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800），翱藝儀器（上海）有限公司；折光儀（LH-F90），杭州陸恒生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：蛋白胨濃度為10 g·L-1，牛肉浸粉濃度為3 g·L-1，葡萄糖濃度為20 g·L-1，氯化鈉濃度為10 g·L-1，水1000 mL，pH為7.0～8.0，裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度37 ℃，振蕩培養(yǎng)18 h。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨濃度為5 g·L-1，谷氨酸鈉濃度為30 g·L-1，氯化鈉濃度為3 g·L-1，磷酸氫二鉀濃度為1 g·L-1，玉米糖化液濃度（按可溶性固形物計(jì)）為40 g·L-1，裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度37 ℃，搖床培養(yǎng)48 h。

搖瓶培養(yǎng)：2%（v/v）的接種量，50 mL/250 mL的裝液量，150 r/min的轉(zhuǎn)速，37 ℃的培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 玉米糖化液的制作

向鍋中加入3000 mL 水，再加入3.0 g 無(wú)水CaCl2，調(diào)節(jié)pH 值為6.7～7.0，加入3000 g 市售玉米粉，攪拌均勻，再加入2.5 g α-耐高溫淀粉酶（酶活為4000 U），加熱至80～85 ℃，保持溫度15～20 min，然后繼續(xù)冷卻至58～60 ℃。調(diào)節(jié)pH 值至4.5 左右，加糖化酶0.1 g（酶活為100 000 U），保持60 ℃左右加熱4 h，再煮沸10 min，用紗布過(guò)濾殘?jiān)?，再用棉花過(guò)濾，得到澄清玉米糖化液。測(cè)定還原糖濃度后，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1）不同碳源及濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響：改變1.2.1 節(jié)“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”中玉米糖化液濃度為30、50、70、90、110 g·L-1與130 g·L-1（按可溶性固形物計(jì)）配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3 組進(jìn)行發(fā)酵。分別用糊精與蔗糖代替1.2.1 節(jié)“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”中的玉米糖化液，并按照糊精（或蔗糖）濃度為10、30、50、70、90 g·L-1與110 g·L-1配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3 組進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后以γ-PGA 的含量為指標(biāo)確定最佳的碳源及其濃度。

（2）不同氮源及濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響：分別用牛肉浸粉或酵母浸粉代替1.2.1節(jié)“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”中的蛋白胨，并按照牛肉浸粉濃度為10、30、50、70、90 g·L-1與110 g·L-1（或酵母浸粉濃度為5、7、9、11、13 g·L-1與15 g·L-1）配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3 組進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后以γ-PGA 的含量為指標(biāo)確定最佳的氮源及其濃度。

（3）氯化鈉的濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響：依據(jù)1.2.1節(jié)中“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度分別為6、8、10、12、14 g·L-1與16 g·L-1，配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3 組進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后以γ-PGA 的含量為指標(biāo)確定最佳的氯化鈉濃度。

（4）磷酸氫二鉀濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響：依據(jù)1.2.1節(jié)中“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀濃度分別為1、2、3、4、5 g·L-1與6 g·L-1，配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3 組進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后以γ-PGA 的含量為指標(biāo)確定最佳的磷酸氫二鉀濃度。

（5）前體物質(zhì)谷氨酸鈉的濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響：依據(jù)1.2.1 節(jié)中“基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基”，改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的谷氨酸鈉濃度分別為0、10、20、30、40 g·L-1與50 g·L-1，配制每組發(fā)酵培養(yǎng)基并平行3組進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后以γ-PGA 的含量為指標(biāo)確定最佳的谷氨酸鈉濃度。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)比其他因子篩選方法更實(shí)用，能以較少的測(cè)試次數(shù)篩選出對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的因子。本試驗(yàn)采用試驗(yàn)次數(shù)為12 組的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，以γ-PGA 產(chǎn)量為響應(yīng)值，選取影響γ-PGA 產(chǎn)量的5 個(gè)主要因素，其中，高水平“1”是低水平“-1”的1.5～2 倍。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果，首先各對(duì)因素的影響進(jìn)行t檢驗(yàn)。選α< 0.05 的因子作為顯著因子進(jìn)行進(jìn)一步研究。Plackett-Burman 試驗(yàn)水平值見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素及其水平

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)曲面需要考慮在一定范圍內(nèi)的區(qū)域才能響應(yīng)設(shè)計(jì)的可行性。當(dāng)多個(gè)因子分別與各自的步長(zhǎng)和方向進(jìn)行移動(dòng)時(shí)就可以大致找出這個(gè)范圍，而這個(gè)移動(dòng)過(guò)程就是最陡爬坡試驗(yàn)。依據(jù)Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量影響顯著的因素，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的方向和步長(zhǎng)。根據(jù)爬升方向上效應(yīng)值的變化，如果有正效應(yīng)，則取高水平再增加；如果有負(fù)效應(yīng)，則取低水平，然后減少。步長(zhǎng)可根據(jù)單因素試驗(yàn)的變化來(lái)確定。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

確定顯著因素的最優(yōu)水平：逼近最大γ-PGA 產(chǎn)量區(qū)后，進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以試驗(yàn)結(jié)果擬合建立描述響應(yīng)量（γ-PGA 產(chǎn)量）與自變量（影響γ-PGA 產(chǎn)量的顯著因素）關(guān)系的多項(xiàng)式回歸模型，再對(duì)擬合方程進(jìn)行規(guī)范性分析，尋找回歸模型的穩(wěn)定點(diǎn)，得到最大γ-PGA 產(chǎn)量時(shí)顯著因素的水平此即最優(yōu)水平，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。Box-Behnken 設(shè)計(jì)的因素水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素水平

1.3 分析方法

1.3.1 CTAB-NaOH 溶液的配置

用天平在準(zhǔn)確稱取5.0000 g氫氧化鈉于燒杯中，加入少量去離子水使其完全溶解，然后倒入100 mL容量瓶中，再取少量去離子水沖洗燒杯并倒入容量瓶，重復(fù)兩次，最后用去離子水定容至100 mL，準(zhǔn)確稱取CTAB 0.2000 g，倒入NaOH溶液中。

1.3.2 γ-PGA濃度的測(cè)定（CTAB比濁法）

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[28]：用標(biāo)準(zhǔn)γ-PGA 樣品配置成10、20、30、40 g·L-1與50 g·L-1的標(biāo)液，分別與1.3.1 節(jié)配制的CTAB-NaOH 溶液1∶1 混合，室溫下反應(yīng)時(shí)間約3 min 后，用預(yù)熱20 min 的紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為250 nm 下測(cè)定其吸光度。繪制γ-PGA（g/L)-OD250nm標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。3 min 后，倒入石英比色皿，用水作為校準(zhǔn)管。在預(yù)熱20 min 并設(shè)置波長(zhǎng)250 nm 的紫外分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度值（OD）。

圖1 γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 可溶性固形物含量的測(cè)定

取適量液體于校準(zhǔn)后的LH-F90 折光儀，對(duì)準(zhǔn)光源，讀取數(shù)值[29]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

所有單因素試驗(yàn)，都進(jìn)行3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，采用Minitab19 與Design Expert 11軟件完成。

2 結(jié)果與討論

（2）發(fā)酵液的測(cè)定：取稀釋的發(fā)酵液，加入等體積CTAB 溶液反應(yīng)，并用旋渦震蕩儀震蕩。反應(yīng)

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源及濃度對(duì)合成γ-PGA的影響

微生物培養(yǎng)基中碳源的類型和濃度對(duì)于微生物的生長(zhǎng)及其合成產(chǎn)物具有重要影響。碳源在微生物生長(zhǎng)代謝中的主要作用是為細(xì)胞提供碳骨架，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。因此，碳源在微生物培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基中起著重要的作用。蔗糖、玉米糖化液和糊精對(duì)合成γ-PGA 的影響如圖2 所示。

圖2 不同碳源及濃度對(duì)合成γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖2 可知，3 種碳源濃度均為50 g/L 時(shí)，玉米糖化液的濃度對(duì)γ-PGA 的產(chǎn)量影響最大，為8.54 g/L，而其他兩種情況下的γ-PGA 的產(chǎn)量分別為4.98 g/L、5.25 g/L。這是因?yàn)椴捎秒p酶法制備的玉米糖化液是將長(zhǎng)鏈的淀粉第一次酶解成相對(duì)小分子的糊精和麥芽糖等二糖，再由糖化酶進(jìn)一步酶解成更小的葡萄糖，因此玉米糖化液中除了有大量的葡萄糖外還有糊精和其他可利用碳源[30]。所以在同一濃度的不同碳源下，玉米糖化液具有更多的可利用碳源種類，使得其較糊精和蔗糖對(duì)微生物發(fā)酵有更大碳源的吸收效率，提供的營(yíng)養(yǎng)更加全面。因此選擇50 g/L的玉米糖化液作為碳源較為適宜。

2.1.2 不同氮源及濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

微生物生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物與氮源的種類和濃度息息相關(guān)，這能夠很大程度上影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。酵母浸粉、牛肉浸粉對(duì)合成γ-PGA 的影響如圖3所示。

圖3 不同氮源及濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

從圖3 可知，γ-PGA 的產(chǎn)量在酵母浸粉濃度為11 g/L 時(shí)可達(dá)到9.04 g/L；γ-PGA 的產(chǎn)量在牛肉浸粉濃度為30 g/L 時(shí)僅為4.17 g/L。因此酵母浸粉在含量較小時(shí)就可以使γ-PGA 的產(chǎn)量達(dá)到較高水平；而牛肉浸粉含量越大特別是30 g/L 以后γ-PGA 的產(chǎn)量反而越小。張雷等[31]在進(jìn)行Bacillus subtilis菌株發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 的培養(yǎng)基優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)在有機(jī)氮源中，酵母浸粉對(duì)γ-PGA 的產(chǎn)量的影響大于牛肉粉，且酵母浸粉營(yíng)養(yǎng)成分為酵母來(lái)源，其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)與微生物較為相似。綜上所述，選擇11 g/L 的酵母浸粉作為氮源較為適宜。

2.1.3 氯化鈉、磷酸氫二鉀與谷氨酸鈉的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

氯化鈉可以調(diào)節(jié)滲透壓、pH值和氧化還原電位。氯化鈉的濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響如圖4（a）所示。由圖可知，γ-PGA 的產(chǎn)量在氯化鈉濃度達(dá)到12 g/L時(shí)，γ-PGA 的產(chǎn)量最大，為6.55 g/L。而后γ-PGA 的產(chǎn)量隨著氯化鈉濃度增加反而下降，這可能是由于鹽濃度增加引起滲透壓增大，阻止了菌體正常的生命代謝活動(dòng)。所以氯化鈉濃度選擇12 g/L。

磷酸氫二鉀具有促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用[32]，磷酸氫二鉀的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖4（b）所示。由圖4（b）所知，磷酸氫二鉀濃度為4 g/L 時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量大幅增加，并在其濃度為5 g/L 時(shí)達(dá)到最大值，為5.20 g/L。所以磷酸氫二鉀的最佳濃度為5 g/L。

生產(chǎn)γ-PGA 的產(chǎn)量較低的一般為γ-PGA 產(chǎn)生菌非谷氨酸依賴型菌株，但是非谷氨酸依賴型菌株的使用，可以用少量的谷氨酸鈉作為前體物質(zhì)得到大量的γ-PGA，這對(duì)于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)具有重要研究意義[33]。谷氨酸鈉濃度對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響如圖4（c）所示。由圖可知，當(dāng)谷氨酸鈉濃度為0 時(shí)仍有γ-PGA 產(chǎn)生，這說(shuō)明本研究所用的枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 是一種非谷氨酸依賴型菌株，該類菌株添加少量谷氨酸鈉就可使γ-PGA 產(chǎn)量增加[28]。當(dāng)谷氨酸鈉濃度為20 g/L時(shí)γ-PGA產(chǎn)量最大。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

利用minitab19 對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析分別見(jiàn)表3 與表4。由表4 可知，R2=0.9722=0.8889，= 0.9491，均接近于1，這說(shuō)明擬合得到的多項(xiàng)式γ-PGA=9.712-0.1288A-0.06783B+0.1311C+0.0444D+0.0746E 與試驗(yàn)很相符，可用來(lái)判別各種影響因素的顯著性。統(tǒng)計(jì)分析所得Pareto圖如圖5所示。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及效應(yīng)值(n=12)

表4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)的各因素的系數(shù)的估計(jì)及效應(yīng)評(píng)價(jià)

圖5 帕累托標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)圖

由圖5可知，上述5個(gè)因素的重要性排序?yàn)锽>C>A>D>E，即玉米糖化液>谷氨酸鈉>酵母浸粉>氯化鈉>磷酸氫二鉀。由表4 可知，酵母浸粉、玉米糖化液、谷氨酸鈉對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量影響比較顯著（置信度大于95%，P< 0.05）。同時(shí)由表4 中T值可知，酵母浸粉和玉米糖化液對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

由1.2.5 節(jié)的試驗(yàn)方法，并取玉米糖化液、谷氨酸鈉、酵母浸粉的步長(zhǎng)分別為-5、+5、-1，初始值分別為40、25 g/L與9 g/L，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡實(shí)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 可知，玉米糖化液濃度為30 g/L，谷氨酸鈉濃度為35 g/L，酵母浸粉濃度為7 g/L 時(shí)γ-PGA 產(chǎn)量最大，可以作為參考點(diǎn)中心值進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

利用Minitab19軟件對(duì)酵母浸粉、玉米糖化液和谷氨酸鈉進(jìn)行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由minitab19回歸分析，γ-PGA產(chǎn)量對(duì)酵母浸粉（A）、玉米糖化液（B）和谷氨酸鈉（C）的多元二次回歸方程為：γ-PGA 產(chǎn)量（g/L）=-39.61+4.651A+0.8275B +1.2036C-0.4078A2-0.01089B2-0.01441C2+0.02025AB+0.01412AC-0.00945BC。

由響應(yīng)值的方差分析（見(jiàn)表7）可知所選擇的回歸模型的P值為0.0002（< 0.1），并且R2= 0.9894，= 0.9704，= 0.8890、失擬項(xiàng)的P值為0.5350（> 0.05），這說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好且失擬程度不顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二次項(xiàng)C2、交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)結(jié)果影響極顯著（P< 0.01）、一次項(xiàng)B對(duì)結(jié)果影響顯著（P< 0.05），表明各因素間對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[34]。

表7 響應(yīng)值的方差分析

通過(guò)二次回歸方程及不同因素對(duì)γ-PGA 產(chǎn)量影響的3D 響應(yīng)面圖（圖6）可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，其所代表的拋物面開(kāi)口向下，表明方程具有最大值。最適酵母浸粉濃度為7.0505 g/L、玉米糖化液濃度為29.0404 g/L、谷氨酸鈉濃度為35.6566 g/L時(shí)，γ-PGA 產(chǎn)量最大，為10.2636 g/L。為便于操作，將上述最優(yōu)條件修正為酵母浸粉濃度為7 g/L、玉米糖化液濃度為30 g/L、谷氨酸鈉濃度為36 g/L。以此作為最優(yōu)條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)檢驗(yàn)，測(cè)得γ-PGA 平均產(chǎn)量為10.2520 g/L，與預(yù)測(cè)產(chǎn)量擬合度達(dá)99.59%，表明優(yōu)化模型可靠。

圖6 不同因素對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響的3D Surface圖

3 結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化后，枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 發(fā)酵合成γ-PGA 產(chǎn)量達(dá)到優(yōu)化前的2 倍。微生物發(fā)酵合成γ-PGA 研究較多，但多數(shù)都因生產(chǎn)成本高而處于實(shí)驗(yàn)室階段。本研究所用碳源及能源為低成本的玉米糖化液，為進(jìn)一步降低成本，培養(yǎng)基中的谷氨酸鈉可以用價(jià)格更為低廉的味精生產(chǎn)原液或是味精廠廢液[35]等代替，從而進(jìn)一步推進(jìn)了微生物發(fā)酵合成γ-PGA產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。