王 帆，張亞新，2，楊計林，2，付龍龍，潘建林，劉小莉，2*

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京 210014 2 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013 3 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所 南京 210017）

河蟹（學(xué)名中華絨螯蟹，Eriocheir sinensis）營養(yǎng)豐富、味道鮮美，是江蘇省最具影響力的淡水水產(chǎn)品之一。由于生鮮河蟹季節(jié)性強，且以鮮活銷售為主，在流通運輸過程中易發(fā)生腐敗變質(zhì)，因此需要采用合理的方法對河蟹產(chǎn)品進行保鮮加工。河蟹肉質(zhì)細嫩，傳統(tǒng)加工方法容易破壞其風(fēng)味和營養(yǎng)，而高功率脈沖微波（high power pulsed microwave，HPPM） 是一種在高功率條件下間歇發(fā)射的微波方式，作為新型冷殺菌技術(shù)具有瞬時作用功率高、穿透力強、不產(chǎn)熱、平均能耗低的優(yōu)點，可在殺滅微生物的同時保持產(chǎn)品原有的風(fēng)味、色澤、質(zhì)地[1-4]。丁香酚常用于水產(chǎn)品等食品保鮮，是一種天然植物源抑菌劑[5-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)丁香酚對河蟹產(chǎn)品中的腐敗菌具有良好的抑制效果[9-10]。采用高功率脈沖微波和丁香酚協(xié)同作用可提高河蟹的產(chǎn)品品質(zhì)和保藏性能。

水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量豐富，而碳水化合物含量較少，其特征性腐敗微生物不同于其它食品[11-12]。在研究水產(chǎn)品貯藏過程中的質(zhì)量變化和預(yù)測貨架期時，優(yōu)先對其特定腐敗菌進行分離、鑒定至關(guān)重要。目前廣泛采用的形態(tài)學(xué)、生理生化分離鑒定和分析方法操作復(fù)雜，且不能真實還原樣品實際的微生物多樣性[13-14]。本研究采用高通量測序技術(shù)分析高功率脈沖微波冷殺菌以及天然植物源抑菌劑丁香酚處理條件下河蟹產(chǎn)品的微生物多樣性，為河蟹貯藏過程中微生物群落演變，以及多技術(shù)組合殺菌工藝的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鮮活河蟹由泰興市江之韻科技發(fā)展有限公司提供，體重為（150±15）g，經(jīng)江蘇省淡水水產(chǎn)研究所鑒定為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，H.Milne-Edwards）。

丁香酚由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

NanoDrop2000 超微量分光光度計，美國Thermo 公司；核酸電泳儀，美國Bio-Rad 公司；GDS-8000 凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；S1000 PCR 擴增儀，美國Bio-Rad 公司；蟹黃吸附設(shè)備及采肉設(shè)備，山東諸城科力機械有限公司；高功率脈沖微波設(shè)備（頻率3GHz，峰值功率900 kW），南京翀電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理和理化指標測定 鮮活河蟹清洗后于100 ℃沸水蒸煮10 min，將熟蟹拆分去除腮和內(nèi)臟，用蟹黃吸附設(shè)備吸取蟹黃或蟹膏，剩余部分（蟹腹、蟹腿和蟹鉗）送入采肉設(shè)備擠壓采肉[15]，將獲得的蟹肉分組裝入包裝盒中進行不同處理。未處理組以UN 表示，添加2 μL/g 丁香酚處理組以E 表示，添加2 μL/g 丁香酚并進行高功率脈沖微波處理組以EM 表示，為避免熱效應(yīng)產(chǎn)生的影響，高功率脈沖微波作用條件選取工作頻率200 Hz（每分鐘脈沖200 次），作用時間5 min。每組處理設(shè)置3 個重復(fù)，處理后的河蟹肉置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，分別在0，1，2，3，4，5 d 取樣液氮速凍后-80 ℃保存。河蟹肉樣品的菌落總數(shù)以及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值的測定方法分別參照食品安全國家標準GB4789.2-2016 《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》以及GB5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.3.2 DNA 提取和PCR 擴增 將河蟹肉樣品采用Omega Bio-tek 細菌基因組DNA 提取試劑盒進行DNA 提取，利用NanoDrop2000 檢測DNA 濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，檢測合格的基因組DNA 置于-20 ℃保存待用。以細菌基因組DNA 為模板，采用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對 細 菌16SrDNA V3～V4 可變區(qū)進行PCR 擴增。擴增體系為20 μL：其中5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA 模板10 ng，加滅菌去離子水補足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：首先98 ℃預(yù)變性3 min，然后進入擴增循環(huán)，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計27 個循環(huán)，最后72 ℃補延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后利用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物并進行純化，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。

1.3.3 高通量測序和數(shù)據(jù)分析 利用Illumina 公司的Miseq PE300 高通量測序平臺進行測序，原始測序序列使用Flash 軟件進行pair-end 雙端序列拼接，使用Trimmomatic 軟件進行質(zhì)控和優(yōu)化，去除質(zhì)量值低于20、堿基模糊、引物錯配或長度小于50 bp 的序列，將獲得的有效基因序列上傳至美吉生物云平臺進行微生物多樣性分析，使用Uparse 軟件（vsesion 7.1）對序列進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU） 聚類，OTU的相似度設(shè)置為97%，聚類的同時使用Uchime 軟件剔除嵌合體，使用RDP Classifier 軟件對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫（Release132），得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息，使用R 語言軟件對數(shù)據(jù)進行評估，并生成各類物種組成、樣本比較分析圖表[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均進行3 次重復(fù)，采用Origin 8.5軟件作圖，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對試驗結(jié)果進行顯著性和相關(guān)性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

利用高通量測序并對數(shù)據(jù)進行拼接、質(zhì)控、優(yōu)化后，共獲得河蟹肉經(jīng)高功率脈沖微波和丁香酚保鮮處理的30 個樣本共1 380 813 個有效序列，不同樣本有效序列均在37 010 個以上（樣品編號：Control 為河蟹肉初始樣品，UN-1、UN-2、UN-3 分別表示未處理組第1，3，5 天河蟹肉樣品，E-1、E-2、E-3 分別表示添加丁香酚處理第1，3，5 天河蟹肉樣品，EM-1、EM-2、EM-3 分別表示添加丁香酚并進行高功率脈沖微波處理第1，3，5 天河蟹肉樣品，每個樣品設(shè)置3 個平行試驗），結(jié)合稀釋曲線隨數(shù)據(jù)量增大趨勢逐漸平緩（圖1），可評估測序序列質(zhì)量良好，可進行下一步數(shù)據(jù)分析。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of samples

為了比較不同處理河蟹肉樣品中所共有和獨有的OTU 數(shù)量，繪制了物種Venn 分析圖（圖2），10 組不同處理的樣品共有82 個共有的OTUs，各組之間的數(shù)據(jù)都有重疊，說明各組之間存在相同的細菌菌群。Control 組獨有38 個OTUs，UN-1、UN-2、UN-3 組分別獨有17，1，2 個OTUs，E-1、E-2、E-3 組分別獨有81，69，41 個OTUs，EM-1、EM-2、EM-3 組分別獨有32，23，44 個OTUs。

圖2 物種Venn 分析圖Fig.2 Venn diagrams on OTU level

豐富度等級圖（Rank-Abundance 曲線）可以反映物種豐富度和群落均勻度，曲線在水平方向的范圍越寬，趨勢越平緩，物種的豐富度就越高、分布就越均勻。從圖3可以看出，UN-2、UN-3 組在水平方向的曲線相比其它組跨度窄、趨勢陡，說明UN-2、UN-3 組物種的豐富度和均勻度較其它組別低。

圖3 豐度等級圖Fig.3 Rank-abundace distribution curves

將樣本中的有效序列聚類成為OTU，對OTU代表序列進行物種組成分析。圖4以直方圖的形式在屬水平上注釋了10 組樣品中菌群的物種信息。河蟹肉初始樣品（control 組）的菌群多樣性較高，主要有黃桿菌屬（Flavobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、假阿倫西亞氏菌屬（Pseudahrensia）、噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophagales）、鐵細菌屬（Crenothrix）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、副球菌屬（Paracoccus）、動性桿菌屬（Planomicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）、根瘤菌屬（Rhizobiales）、動孢囊菌屬（Kineosporia）、嗜酸菌屬（Acidovorax）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。未處理組第1，3，5 天河蟹肉樣品（UN-1、UN-2、UN-3）中芽孢桿菌屬豐度隨著貯藏時間的延長逐漸升高，尤其第3，5 天樣品中芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢腐敗菌。丁香酚處理組（E-1、E-2、E-3） 和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組（EM-1、EM-2、EM-3） 各樣品菌群組成與初始樣品相似，豐度比例稍有不同，樣品貯藏后期開始出現(xiàn)芽孢桿菌屬，但其豐度顯著低于未處理組，說明丁香酚和高功率脈沖微波處理對河蟹肉樣品中的優(yōu)勢腐敗菌具有較強的抑制作用。

圖4 屬水平物種組成分析直方圖Fig.4 Community barplot analysis on genus level

圖5以群落Heatmap 圖的形式呈現(xiàn)了不同處理河蟹肉樣品在屬水平上物種組成和豐度的分析結(jié)果，群落Heatmap 圖以顏色梯度來表征數(shù)據(jù)大小，顏色深淺變化表示物種在各組樣品中所占比例情況。圖中芽孢桿菌屬在未處理組第3，5 天的樣品（UN-2、UN-3）中成為優(yōu)勢腐敗菌，而其它菌群所占比例降低。丁香酚處理和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理在一定程度上能延緩優(yōu)勢腐敗菌群芽孢桿菌屬的增殖，經(jīng)過保鮮處理后其它菌群的組成和豐度與初始樣品相比變化不大，該結(jié)果與直方圖一致。

圖5 屬水平物種組成分析Heatmap 圖Fig.5 Community heatmap analysis on genus level

根據(jù)屬水平上的物種組成和豐度分析結(jié)果，進一步對所有樣本進行了層級聚類分析，圖6以樣本層級聚類樹的形式展現(xiàn)了不同樣本屬水平群落結(jié)構(gòu)相似或差異關(guān)系，圖中樹之間的長度代表樣本間的距離，由圖可知未處理組第3，5 天的樣品（UN-2、UN-3）與其余組群落組成差異顯著，經(jīng)過丁香酚和高功率脈沖微波保鮮處理的樣品和初始樣品均在同一個分支上，說明其菌群組成相類似。

圖6 屬水平樣本層級聚類樹Fig.6 Hierarchical clustering tree on genus level

2.2 理化指標測定

不同處理對河蟹肉樣品貯藏過程中菌落總數(shù)的影響如圖7所示。河蟹肉初始樣品的菌落總數(shù)為2.80 lg（CFU/g），所有樣品的菌落總數(shù)隨著貯藏時間的增加而逐漸升高，UN 組升高最為迅速。Cai 等[18]研究提出，水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)或者到達貨架期終點的限量應(yīng)為7 lg（CFU/g），UN 組在貯藏的第2 天菌落總數(shù)即達到了7.29 lg（CFU/g），在貯藏的第5 天達到了8.04 lg（CFU/g）。而經(jīng)過保鮮處理的E 組和EM 組，菌落總數(shù)在貯藏的第5 天分別達到7.2 lg（CFU/g）和5.85 lg（CFU/g），與UN 組相比顯著（P＜0.05）降低。試驗結(jié)果表明，丁香酚處理以及高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理對河蟹肉樣品菌落總數(shù)的升高有一定的抑制作用，且協(xié)同處理組保鮮效果更好，可延長樣品貯藏期。

圖7 不同處理對河蟹肉樣品貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effect of different treatments on total viable count in crab meat during storage

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量可作為判斷水產(chǎn)品腐敗程度的指標，根據(jù)食品安全國家標準GB 2733-2015《鮮、凍動物性水產(chǎn)品》TVB-N 限量不應(yīng)超過15 mg/100 g。由圖8可知，河蟹肉初始樣品的TVB-N 含量為8.77 mg/100g，在貯藏過程中3 組樣品的TVB-N 含量隨著時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，E 組和EM 組TVB-N 含量與UN 組相比增長緩慢。UN 組在貯藏的第3 天TVB-N 含量已經(jīng)達到17.74 mg/100 g，在貯藏的第5 天達到了21.67 mg/100 g。E 組和EM 組的TVB-N 含量在5 d 的貯藏過程中一直小于15 mg/100 g，在貯藏的第5 天分別達到13.53 mg/100 g 和11.67 mg/100 g，與UN 組相比顯著（P＜0.05）降低。試驗結(jié)果表明，丁香酚處理以及高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理具有較好的保鮮作用，可以延緩河蟹肉樣品的腐敗。

圖8 不同處理對河蟹肉樣品貯藏過程中TVB-N 值的影響Fig.8 Effect of different treatments on TVB-N values in crab meat during storage

3 結(jié)論與討論

本研究采用丁香酚以及高功率脈沖微波技術(shù)對河蟹肉樣品進行保鮮處理。未處理組樣品在貯藏的第2 天菌落總數(shù)已達到腐敗標準，在貯藏的第3 天揮發(fā)性鹽基氮含量超過限量15 mg/100 g，而丁香酚處理組和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組分別在樣品貯藏的第4 天和第5 天仍可以保持新鮮度。通過高通量測序技術(shù)對不同處理方式河蟹肉樣品貯藏過程中微生物的多樣性進行分析，結(jié)果顯示各組樣品微生物的多樣性以及豐富度存在相似性和差異性。河蟹肉初始樣品的菌群多樣性較高，主要有黃桿菌屬（Flavobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、假阿倫西亞氏菌屬（Pseudahrensia）、噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophagales）、鐵細菌屬（Crenothrix）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、副球菌屬（Paracoccus）、動性桿菌屬（Planomicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）、根瘤菌屬（Rhizobiales）、動孢囊菌屬（Kineosporia）、嗜酸菌屬（Acidovorax）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。未處理組樣品中芽孢桿菌屬豐度隨著貯藏時間的延長明顯升高成為優(yōu)勢腐敗菌，微生物的多樣性和豐富度相比其余組差異顯著。耐熱的芽孢桿菌屬成為樣品中的優(yōu)勢腐敗菌可能是因為河蟹在前處理過程中經(jīng)過沸水的蒸煮[19]。丁香酚處理組和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組各樣品菌群組成與初始樣品相似，豐度比例稍有不同，樣品貯藏后期開始出現(xiàn)芽孢桿菌屬，但其豐度顯著低于未處理組。試驗結(jié)果表明，高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理對河蟹肉樣品中的優(yōu)勢腐敗菌芽孢桿菌屬具有較強的抑制作用，顯著延緩了河蟹肉在貯藏過程中菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量的增長速度，起到保鮮作用。黃明等[20]研究表明，在相同的加熱溫度和時間下，微波對枯草桿菌芽孢的致死率要高于水浴的致死率，是熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。高功率脈沖微波具有瞬時高能和間歇作用的特點，如果控制其作用條件，避免熱效應(yīng)產(chǎn)生的影響，則可以利用非熱效應(yīng)達到殺菌保鮮的目的，為冷殺菌工藝提供了新的思路和方法，后期將進一步深入開展高功率脈沖微波對芽孢桿菌的殺滅機理研究。