王 帆，張亞新，2，楊計(jì)林，2，付龍龍，潘建林，劉小莉，2*

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京 210014 2 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013 3 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所 南京 210017）

河蟹（學(xué)名中華絨螯蟹，Eriocheir sinensis）營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，是江蘇省最具影響力的淡水水產(chǎn)品之一。由于生鮮河蟹季節(jié)性強(qiáng)，且以鮮活銷(xiāo)售為主，在流通運(yùn)輸過(guò)程中易發(fā)生腐敗變質(zhì)，因此需要采用合理的方法對(duì)河蟹產(chǎn)品進(jìn)行保鮮加工。河蟹肉質(zhì)細(xì)嫩，傳統(tǒng)加工方法容易破壞其風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，而高功率脈沖微波（high power pulsed microwave，HPPM） 是一種在高功率條件下間歇發(fā)射的微波方式，作為新型冷殺菌技術(shù)具有瞬時(shí)作用功率高、穿透力強(qiáng)、不產(chǎn)熱、平均能耗低的優(yōu)點(diǎn)，可在殺滅微生物的同時(shí)保持產(chǎn)品原有的風(fēng)味、色澤、質(zhì)地[1-4]。丁香酚常用于水產(chǎn)品等食品保鮮，是一種天然植物源抑菌劑[5-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)丁香酚對(duì)河蟹產(chǎn)品中的腐敗菌具有良好的抑制效果[9-10]。采用高功率脈沖微波和丁香酚協(xié)同作用可提高河蟹的產(chǎn)品品質(zhì)和保藏性能。

水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量豐富，而碳水化合物含量較少，其特征性腐敗微生物不同于其它食品[11-12]。在研究水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中的質(zhì)量變化和預(yù)測(cè)貨架期時(shí)，優(yōu)先對(duì)其特定腐敗菌進(jìn)行分離、鑒定至關(guān)重要。目前廣泛采用的形態(tài)學(xué)、生理生化分離鑒定和分析方法操作復(fù)雜，且不能真實(shí)還原樣品實(shí)際的微生物多樣性[13-14]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析高功率脈沖微波冷殺菌以及天然植物源抑菌劑丁香酚處理?xiàng)l件下河蟹產(chǎn)品的微生物多樣性，為河蟹貯藏過(guò)程中微生物群落演變，以及多技術(shù)組合殺菌工藝的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鮮活河蟹由泰興市江之韻科技發(fā)展有限公司提供，體重為（150±15）g，經(jīng)江蘇省淡水水產(chǎn)研究所鑒定為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，H.Milne-Edwards）。

丁香酚由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司；核酸電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；GDS-8000 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP 公司；S1000 PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；蟹黃吸附設(shè)備及采肉設(shè)備，山東諸城科力機(jī)械有限公司；高功率脈沖微波設(shè)備（頻率3GHz，峰值功率900 kW），南京翀電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理和理化指標(biāo)測(cè)定 鮮活河蟹清洗后于100 ℃沸水蒸煮10 min，將熟蟹拆分去除腮和內(nèi)臟，用蟹黃吸附設(shè)備吸取蟹黃或蟹膏，剩余部分（蟹腹、蟹腿和蟹鉗）送入采肉設(shè)備擠壓采肉[15]，將獲得的蟹肉分組裝入包裝盒中進(jìn)行不同處理。未處理組以UN 表示，添加2 μL/g 丁香酚處理組以E 表示，添加2 μL/g 丁香酚并進(jìn)行高功率脈沖微波處理組以EM 表示，為避免熱效應(yīng)產(chǎn)生的影響，高功率脈沖微波作用條件選取工作頻率200 Hz（每分鐘脈沖200 次），作用時(shí)間5 min。每組處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，處理后的河蟹肉置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，分別在0，1，2，3，4，5 d 取樣液氮速凍后-80 ℃保存。河蟹肉樣品的菌落總數(shù)以及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值的測(cè)定方法分別參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》以及GB5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》。

1.3.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 將河蟹肉樣品采用Omega Bio-tek 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，利用NanoDrop2000 檢測(cè)DNA 濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，檢測(cè)合格的基因組DNA 置于-20 ℃保存待用。以細(xì)菌基因組DNA 為模板，采用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對(duì) 細(xì) 菌16SrDNA V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL：其中5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA 模板10 ng，加滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：首先98 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計(jì)27 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃補(bǔ)延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后利用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物并進(jìn)行純化，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 利用Illumina 公司的Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，原始測(cè)序序列使用Flash 軟件進(jìn)行pair-end 雙端序列拼接，使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控和優(yōu)化，去除質(zhì)量值低于20、堿基模糊、引物錯(cuò)配或長(zhǎng)度小于50 bp 的序列，將獲得的有效基因序列上傳至美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行微生物多樣性分析，使用Uparse 軟件（vsesion 7.1）對(duì)序列進(jìn)行分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units，OTU） 聚類(lèi)，OTU的相似度設(shè)置為97%，聚類(lèi)的同時(shí)使用Uchime 軟件剔除嵌合體，使用RDP Classifier 軟件對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132），得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，使用R 語(yǔ)言軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，并生成各類(lèi)物種組成、樣本比較分析圖表[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用Origin 8.5軟件作圖，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性分析

利用高通量測(cè)序并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控、優(yōu)化后，共獲得河蟹肉經(jīng)高功率脈沖微波和丁香酚保鮮處理的30 個(gè)樣本共1 380 813 個(gè)有效序列，不同樣本有效序列均在37 010 個(gè)以上（樣品編號(hào)：Control 為河蟹肉初始樣品，UN-1、UN-2、UN-3 分別表示未處理組第1，3，5 天河蟹肉樣品，E-1、E-2、E-3 分別表示添加丁香酚處理第1，3，5 天河蟹肉樣品，EM-1、EM-2、EM-3 分別表示添加丁香酚并進(jìn)行高功率脈沖微波處理第1，3，5 天河蟹肉樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行試驗(yàn)），結(jié)合稀釋曲線隨數(shù)據(jù)量增大趨勢(shì)逐漸平緩（圖1），可評(píng)估測(cè)序序列質(zhì)量良好，可進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of samples

為了比較不同處理河蟹肉樣品中所共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)量，繪制了物種Venn 分析圖（圖2），10 組不同處理的樣品共有82 個(gè)共有的OTUs，各組之間的數(shù)據(jù)都有重疊，說(shuō)明各組之間存在相同的細(xì)菌菌群。Control 組獨(dú)有38 個(gè)OTUs，UN-1、UN-2、UN-3 組分別獨(dú)有17，1，2 個(gè)OTUs，E-1、E-2、E-3 組分別獨(dú)有81，69，41 個(gè)OTUs，EM-1、EM-2、EM-3 組分別獨(dú)有32，23，44 個(gè)OTUs。

圖2 物種Venn 分析圖Fig.2 Venn diagrams on OTU level

豐富度等級(jí)圖（Rank-Abundance 曲線）可以反映物種豐富度和群落均勻度，曲線在水平方向的范圍越寬，趨勢(shì)越平緩，物種的豐富度就越高、分布就越均勻。從圖3可以看出，UN-2、UN-3 組在水平方向的曲線相比其它組跨度窄、趨勢(shì)陡，說(shuō)明UN-2、UN-3 組物種的豐富度和均勻度較其它組別低。

圖3 豐度等級(jí)圖Fig.3 Rank-abundace distribution curves

將樣本中的有效序列聚類(lèi)成為OTU，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種組成分析。圖4以直方圖的形式在屬水平上注釋了10 組樣品中菌群的物種信息。河蟹肉初始樣品（control 組）的菌群多樣性較高，主要有黃桿菌屬（Flavobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、假阿倫西亞氏菌屬（Pseudahrensia）、噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophagales）、鐵細(xì)菌屬（Crenothrix）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、副球菌屬（Paracoccus）、動(dòng)性桿菌屬（Planomicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）、根瘤菌屬（Rhizobiales）、動(dòng)孢囊菌屬（Kineosporia）、嗜酸菌屬（Acidovorax）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。未處理組第1，3，5 天河蟹肉樣品（UN-1、UN-2、UN-3）中芽孢桿菌屬豐度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，尤其第3，5 天樣品中芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。丁香酚處理組（E-1、E-2、E-3） 和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組（EM-1、EM-2、EM-3） 各樣品菌群組成與初始樣品相似，豐度比例稍有不同，樣品貯藏后期開(kāi)始出現(xiàn)芽孢桿菌屬，但其豐度顯著低于未處理組，說(shuō)明丁香酚和高功率脈沖微波處理對(duì)河蟹肉樣品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖4 屬水平物種組成分析直方圖Fig.4 Community barplot analysis on genus level

圖5以群落Heatmap 圖的形式呈現(xiàn)了不同處理河蟹肉樣品在屬水平上物種組成和豐度的分析結(jié)果，群落Heatmap 圖以顏色梯度來(lái)表征數(shù)據(jù)大小，顏色深淺變化表示物種在各組樣品中所占比例情況。圖中芽孢桿菌屬在未處理組第3，5 天的樣品（UN-2、UN-3）中成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，而其它菌群所占比例降低。丁香酚處理和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理在一定程度上能延緩優(yōu)勢(shì)腐敗菌群芽孢桿菌屬的增殖，經(jīng)過(guò)保鮮處理后其它菌群的組成和豐度與初始樣品相比變化不大，該結(jié)果與直方圖一致。

圖5 屬水平物種組成分析Heatmap 圖Fig.5 Community heatmap analysis on genus level

根據(jù)屬水平上的物種組成和豐度分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)所有樣本進(jìn)行了層級(jí)聚類(lèi)分析，圖6以樣本層級(jí)聚類(lèi)樹(shù)的形式展現(xiàn)了不同樣本屬水平群落結(jié)構(gòu)相似或差異關(guān)系，圖中樹(shù)之間的長(zhǎng)度代表樣本間的距離，由圖可知未處理組第3，5 天的樣品（UN-2、UN-3）與其余組群落組成差異顯著，經(jīng)過(guò)丁香酚和高功率脈沖微波保鮮處理的樣品和初始樣品均在同一個(gè)分支上，說(shuō)明其菌群組成相類(lèi)似。

圖6 屬水平樣本層級(jí)聚類(lèi)樹(shù)Fig.6 Hierarchical clustering tree on genus level

2.2 理化指標(biāo)測(cè)定

不同處理對(duì)河蟹肉樣品貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的影響如圖7所示。河蟹肉初始樣品的菌落總數(shù)為2.80 lg（CFU/g），所有樣品的菌落總數(shù)隨著貯藏時(shí)間的增加而逐漸升高，UN 組升高最為迅速。Cai 等[18]研究提出，水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)或者到達(dá)貨架期終點(diǎn)的限量應(yīng)為7 lg（CFU/g），UN 組在貯藏的第2 天菌落總數(shù)即達(dá)到了7.29 lg（CFU/g），在貯藏的第5 天達(dá)到了8.04 lg（CFU/g）。而經(jīng)過(guò)保鮮處理的E 組和EM 組，菌落總數(shù)在貯藏的第5 天分別達(dá)到7.2 lg（CFU/g）和5.85 lg（CFU/g），與UN 組相比顯著（P＜0.05）降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香酚處理以及高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理對(duì)河蟹肉樣品菌落總數(shù)的升高有一定的抑制作用，且協(xié)同處理組保鮮效果更好，可延長(zhǎng)樣品貯藏期。

圖7 不同處理對(duì)河蟹肉樣品貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effect of different treatments on total viable count in crab meat during storage

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量可作為判斷水產(chǎn)品腐敗程度的指標(biāo)，根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2733-2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》TVB-N 限量不應(yīng)超過(guò)15 mg/100 g。由圖8可知，河蟹肉初始樣品的TVB-N 含量為8.77 mg/100g，在貯藏過(guò)程中3 組樣品的TVB-N 含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，E 組和EM 組TVB-N 含量與UN 組相比增長(zhǎng)緩慢。UN 組在貯藏的第3 天TVB-N 含量已經(jīng)達(dá)到17.74 mg/100 g，在貯藏的第5 天達(dá)到了21.67 mg/100 g。E 組和EM 組的TVB-N 含量在5 d 的貯藏過(guò)程中一直小于15 mg/100 g，在貯藏的第5 天分別達(dá)到13.53 mg/100 g 和11.67 mg/100 g，與UN 組相比顯著（P＜0.05）降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香酚處理以及高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理具有較好的保鮮作用，可以延緩河蟹肉樣品的腐敗。

圖8 不同處理對(duì)河蟹肉樣品貯藏過(guò)程中TVB-N 值的影響Fig.8 Effect of different treatments on TVB-N values in crab meat during storage

3 結(jié)論與討論

本研究采用丁香酚以及高功率脈沖微波技術(shù)對(duì)河蟹肉樣品進(jìn)行保鮮處理。未處理組樣品在貯藏的第2 天菌落總數(shù)已達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)，在貯藏的第3 天揮發(fā)性鹽基氮含量超過(guò)限量15 mg/100 g，而丁香酚處理組和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組分別在樣品貯藏的第4 天和第5 天仍可以保持新鮮度。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同處理方式河蟹肉樣品貯藏過(guò)程中微生物的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各組樣品微生物的多樣性以及豐富度存在相似性和差異性。河蟹肉初始樣品的菌群多樣性較高，主要有黃桿菌屬（Flavobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、假阿倫西亞氏菌屬（Pseudahrensia）、噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophagales）、鐵細(xì)菌屬（Crenothrix）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）、副球菌屬（Paracoccus）、動(dòng)性桿菌屬（Planomicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）、根瘤菌屬（Rhizobiales）、動(dòng)孢囊菌屬（Kineosporia）、嗜酸菌屬（Acidovorax）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。未處理組樣品中芽孢桿菌屬豐度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，微生物的多樣性和豐富度相比其余組差異顯著。耐熱的芽孢桿菌屬成為樣品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌可能是因?yàn)楹有吩谇疤幚磉^(guò)程中經(jīng)過(guò)沸水的蒸煮[19]。丁香酚處理組和高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理組各樣品菌群組成與初始樣品相似，豐度比例稍有不同，樣品貯藏后期開(kāi)始出現(xiàn)芽孢桿菌屬，但其豐度顯著低于未處理組。試驗(yàn)結(jié)果表明，高功率脈沖微波協(xié)同丁香酚處理對(duì)河蟹肉樣品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌芽孢桿菌屬具有較強(qiáng)的抑制作用，顯著延緩了河蟹肉在貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量的增長(zhǎng)速度，起到保鮮作用。黃明等[20]研究表明，在相同的加熱溫度和時(shí)間下，微波對(duì)枯草桿菌芽孢的致死率要高于水浴的致死率，是熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。高功率脈沖微波具有瞬時(shí)高能和間歇作用的特點(diǎn)，如果控制其作用條件，避免熱效應(yīng)產(chǎn)生的影響，則可以利用非熱效應(yīng)達(dá)到殺菌保鮮的目的，為冷殺菌工藝提供了新的思路和方法，后期將進(jìn)一步深入開(kāi)展高功率脈沖微波對(duì)芽孢桿菌的殺滅機(jī)理研究。