高 珊，徐 磊，王 心，閆瞡圓，許 歡，張 倩，陳曉明

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 江蘇淮安 223003）

薏米又名薏苡仁、六谷米等，為一年生或多年生禾本科植物，在包括我國在內(nèi)的許多亞洲國家都有悠久的種植歷史[1]。薏米富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)以及富有生理活性的植物甾醇、薏苡仁內(nèi)酯、多酚等化合物[2]，是一種典型的藥食兩用資源?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)薏米具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]，提高機(jī)體免疫[5]等功能。薏米在精加工過程中產(chǎn)生大量的薏米麩皮，薏米麩皮作為薏米加工的副產(chǎn)物目前利用率仍較低，大部分被直接丟棄或少部分用作飼料、薏米油提取[6]。薏米麩皮較薏米籽粒其它部位具有更高含量的多酚類物質(zhì)，具有較高的利用價(jià)值[7]。多酚是一種廣泛存在于植物體皮、根、葉和果實(shí)中的重要次生代謝物，可由一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)組成，且在芳香環(huán)上至少存在一個(gè)羥基取代基。根據(jù)多酚芳香環(huán)的數(shù)量及附著在芳香環(huán)上的結(jié)構(gòu)部分，可將其分為酚酸、黃酮、鞣質(zhì)和木脂素等[8]。目前，多酚被證實(shí)具有良好的抗氧化[6]、抗腫瘤[9]和治療高尿酸血癥[7]等功能。然而，多酚因特殊的酚羥基結(jié)構(gòu)，存在水溶性差、分子穩(wěn)定性低等問題，故限制了其實(shí)際應(yīng)用[10]。矯馨瑤等[11]研究發(fā)現(xiàn)外界加工條件，如pH 值、溫度、光照、防腐劑、糖濃度和氧化劑都對(duì)藍(lán)莓多酚的穩(wěn)定性和抗氧化活性有較大影響。Fang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)貯藏溫度、水分活度可顯著影響楊梅多酚的穩(wěn)定性。通過有效的技術(shù)手段提高多酚在加工和貯存過程中的穩(wěn)定性具有重要意義。

環(huán)糊精是由D-（+）-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4-葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖，因特殊的中空?qǐng)A錐形結(jié)構(gòu)而使其具有疏水空腔和親水外表面[13]。β-CD 是目前應(yīng)用最廣泛的環(huán)糊精，由7個(gè)葡萄糖單元組成。疏水空腔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)使得環(huán)糊精能在不改變客體化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下完全或部分包封多種客體分子，主客體分子之間主要通過范德華力、疏水相互作用、氫鍵等作用力形成包合物。研究發(fā)現(xiàn)在與環(huán)糊精形成包合物后，客體分子的許多物理和化學(xué)性質(zhì)都會(huì)得到明顯改善[10]。王軼博等[14]制備了楊梅素與葡萄糖基-β-CD 包合物，發(fā)現(xiàn)楊梅素通過包合，水中溶解度提高了70.24 倍，同時(shí)其自由基清除能力明顯提高。Rodrigues 等[15]通過共蒸發(fā)法制備羅勒精油與β-CD的包合物，發(fā)現(xiàn)羅勒精油的熱穩(wěn)定性和抗炎活性顯著提高。薏米中的多酚化合物在受熱條件下很容易發(fā)生降解[16]，然而，目前有關(guān)提高其穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道。

本文以薏米加工副產(chǎn)物脫脂薏米麩皮為原料制備ABP，將其與β-CD 進(jìn)行復(fù)合處理得到ABP/β-CD 包合物，研究該包合物的理化特性，以期提高ABP 的利用率，為其相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABP：本實(shí)驗(yàn)室自制，新鮮薏米麩皮由福建省浦城縣官路神農(nóng)薏米專業(yè)合作社提供，麩皮經(jīng)正己烷脫脂后先進(jìn)行孵育處理以充分釋放麩皮中的酚類物質(zhì)[17]，接著用80%乙醇提取酚類物質(zhì)，然后將粗提液用AB-8 大孔樹脂分離純化，洗脫液經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥，粉碎過篩后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

β-CD，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（Trolox）、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-2C 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR），美國賽默飛世爾科技有限公司；SmartLab 9kw X 射線衍射儀（X-ray Diffraction，XRD），日本Rigaku公司；STA449 F3 熱重-差示掃描量熱儀（thermogravimetry-differential scanning calorimetry，TGDSC），德國Netzsch 公司；SEU8010 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM），日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 ABP/β-環(huán)糊精包合物的制備 采用冷凍干燥法制備包合物[18]，先將3.78 g β-CD 完全溶解于100 mL 去離子水中，再加入0.63 g ABP，40 ℃保溫?cái)嚢? h，冷凍干燥后得到ABP/β-CD 包合物。將ABP 與β-CD 按質(zhì)量比1∶6 在研缽中充分研磨混合即得到物理混合物。

1.3.2 紫外光譜分析 準(zhǔn)確稱取ABP（1 mg）、β-CD（6 mg）、ABP/β-CD 包合物（7 mg），分別溶解于10 mL 去離子水中，測(cè)定其在220～400 nm 波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，掃描間隔為1 nm。

1.3.3 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法對(duì)ABP、β-CD、ABP/β-CD 包合物及物理混合物進(jìn)行紅外光譜分析，按照質(zhì)量比1∶100 分別稱取樣品與溴化鉀，于研缽中充分研磨混勻后壓片，然后采用FTIR 以4 cm-1的分辨率在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)掃描樣品，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.4 XRD 分析 對(duì)ABP、β-CD、ABP/β-CD 包合物及物理混合物進(jìn)行XRD 分析，測(cè)試時(shí)采用Cu 靶Kα 射線，波長為0.154 nm，掃描范圍2θ 為5°～45°，掃描速率為10°/min。

1.3.5 熱特性分析 對(duì)ABP、β-CD、ABP/β-CD 包合物及物理混合物進(jìn)行熱特性分析，稱取適量樣品均勻分散在Al2O3坩堝中，使用TG-DSC 測(cè)量樣品的熱特性，以10 ℃/min 的升溫速率將樣品從30 ℃加熱到600 ℃，測(cè)試過程中控制氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

1.3.6 SEM 分析 對(duì)ABP、β-CD、ABP/β-CD 包合物及物理混合物進(jìn)行SEM 分析，取適量樣品用雙面膠帶固定于銅短管上，然后真空噴金以增強(qiáng)導(dǎo)電性，在5 kV 的加速電壓下進(jìn)行樣品形貌觀察。

1.3.7 抗氧化活性分析 準(zhǔn)確稱取ABP（5 mg）和ABP/β-CD 包合物（35 mg），分別溶解于100 mL去離子水中，采用ABTS 和FRAP 法測(cè)定溶液的抗氧化活性，結(jié)果以Trolox 當(dāng)量表示，單位為mmol TE/L。ABTS 陽離子自由基清除能力的測(cè)定參考Xu 等[17]的方法，準(zhǔn)確移取100 μL 樣品溶液和3.9 mL ABTS 陽離子自由基工作液于10 mL 離心管中，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min 后于734 nm 處測(cè)定吸光值。FRAP 的測(cè)定參考Katalinic等[19]的方法，準(zhǔn)確移取90 μL 樣品溶液和270 μL去離子水于10 mL 離心管中，然后加入2.7 mL FRAP 試劑，充分混勻后室溫避光反應(yīng)30 min 后于593 nm 處測(cè)定吸光值。

1.3.8 溶液光照穩(wěn)定性分析 參照Liu 等[20]的方法對(duì)ABP 和ABP/β-CD 包合物進(jìn)行水溶液光照穩(wěn)定性分析。準(zhǔn)確稱取ABP（1 mg）和ABP/β-CD包合物（7 mg），分別溶解于10 mL 去離子水中，于室溫條件下白熾燈光照48 h，每隔一段時(shí)間取樣。采用Folin-Ciocalteu 法[7]測(cè)定溶液中總酚含量，并計(jì)算總酚保留率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，P＜0.05 有顯著性差異，使用Origin Pro 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

ABP、β-CD、及其包合物的紫外光譜圖如圖1所示。β-CD 沒有不飽和結(jié)構(gòu)，因而其在220～400 nm 范圍內(nèi)幾乎沒有任何吸收，而ABP 具有苯環(huán)、羰基等不飽和結(jié)構(gòu)，其在284 nm 有特征吸收峰[21]。在ABP 和β-CD 形成包合物后，特征吸收峰位置未發(fā)生明顯變化，其強(qiáng)度明顯增加。馮光炷等[22]研究了β-CD 對(duì)β-胡蘿卜素紫外吸收光譜的影響，研究發(fā)現(xiàn)隨著β-CD 的濃度增加β-胡蘿卜素的吸光度增加而吸收波長未發(fā)生變化，這與本文的研究結(jié)果一致。當(dāng)與客體分子形成復(fù)合物后，β-CD 疏水空腔內(nèi)較高的電子云密度可引發(fā)客體分子電子云的微攏或流動(dòng)，從而引起客體分子紫外光譜峰位移或增強(qiáng)。

圖1 ABP（a）、β-CD（b）和ABP/β-CD 包合物（c）紫外光譜圖Fig.1 UV scanning results of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（c）

2.2 紅外光譜分析

紅外光譜是一種研究分子運(yùn)動(dòng)吸收光譜的技術(shù)，可分析短程范圍內(nèi)分子結(jié)構(gòu)變化[23]。ABP、β-CD 及其混合物和包合物在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外譜圖如圖2所示。ABP 在3 388 cm-1處出現(xiàn)O-H 的特征峰，1 689 cm-1處出現(xiàn)C=O 的特征吸收峰，1 602，1 515 和1 449 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)骨架振動(dòng)產(chǎn)生的峰，而β-CD 在3 377 cm-1處出現(xiàn)O-H 的特征峰，2 925 cm-1處出現(xiàn)亞甲基的特征峰，1 030 cm-1處出現(xiàn)糖苷鍵的特征峰，1 156，1 079和1 030 cm-1處出現(xiàn)C-H、C-O 的伸縮振動(dòng)峰[24]。在ABP 與β-CD 物理混合物的紅外光譜基中，既包含了O-H、亞甲基的吸收峰，也包含了C=O、苯環(huán)骨架的振動(dòng)峰，基本上為二者紅外光譜的簡(jiǎn)單疊加，表明ABP 與β-CD 保留了各自的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。而其包合物的圖譜整體上更接近于β-CD，ABP 在1 200～1 700 cm-1之間的大部分特征吸收峰明顯減弱，該結(jié)果表明ABP 的芳香環(huán)已進(jìn)入β-CD 疏水腔體內(nèi)成功形成包合物[25]。

圖2 ABP（a）、β-CD（b）、ABP 與β-CD 物理混合物（c）和ABP/β-CD 包合物（d）紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），physical mixture of adlay bran polyphenols and β-CD（c），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（d）

2.3 XRD 分析

XRD 已被證實(shí)是一種表征環(huán)糊精包合物中主客體相互作用的有效方法[26]。ABP、β-CD 及其混合物和包合物的XRD 結(jié)果如圖3所示。ABP 和β-CD 呈現(xiàn)明顯的晶型結(jié)構(gòu)，擁有眾多強(qiáng)烈而尖銳的衍射峰。在ABP 與β-CD 物理混合物的XRD 圖中，均能觀察到ABP 和β-CD 尖銳的結(jié)晶衍射峰，而在二者的包合物圖譜中尖銳的結(jié)晶衍射峰消失，僅在2θ 為12.4°和17.6°附近有兩個(gè)寬大的吸收峰。此表明在ABP 和β-CD 物理混合物中只是簡(jiǎn)單的主客體混合，而在包合物中主客體之間發(fā)生了明顯的化學(xué)作用[14]。當(dāng)ABP 與β-CD 形成包合物時(shí)，客體ABP 進(jìn)入主體分子空腔內(nèi)與β-CD發(fā)生相互作用，可使ABP 與β-CD 的結(jié)晶度降低或消失。Shao 等[25]在綠原酸/環(huán)糊精包合物的研究中也報(bào)道了類似的現(xiàn)象。

圖3 ABP（a）、β-CD（b）、ABP 與β-CD 物理混合物（c）和ABP/β-CD 包合物（d）XRD 圖Fig.3 XRD patterns of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），physical mixture of adlay bran polyphenols and β-CD（c），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（d）

2.4 熱特性分析

主客體分子發(fā)生包合作用時(shí)可引發(fā)其吸、放熱峰的消失或移動(dòng)，導(dǎo)致晶體熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、焓值等的變化[27]。ABP、β-CD 及其物理混合物和包合物的DSC 圖譜如圖4所示。由圖可知，ABP 在158.4 和236.4 ℃處有兩個(gè)吸熱峰，而β-CD 則分別在94.5和321.7 ℃處有兩個(gè)吸熱峰。當(dāng)ABP 和β-CD 物理混合后，在89.8 和329.6 ℃處出現(xiàn)兩個(gè)大的吸熱峰，此外在158.4 ℃處仍可以明顯分辨出屬于ABP 的特征吸熱峰。當(dāng)二者形成包合物時(shí)僅在75.1 和321.1 ℃處出現(xiàn)兩個(gè)大的吸熱峰，而158.4 ℃處的ABP 特征吸熱峰已無法分辨出。同時(shí)，ABP/β-CD 包合物在321.1 ℃處吸熱峰的焓值（102.3 J/g）要顯著低于二者物理混合物在329.6 ℃處吸熱峰的焓值（150.7 J/g）。

圖4 ABP（a）、β-CD（b）、ABP 與β-CD 物理混合物（c）和ABP/β-CD 包合物（d）DSC 圖Fig.4 DSC curves of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），physical mixture of adlay bran polyphenols and β-CD（c），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（d）

ABP、β-CD 及其物理混合物和包合物的TG圖譜如圖5所示。從圖1中可以看出，β-CD 的熱解過程分為兩個(gè)階段，其峰值分別出現(xiàn)在90.3 和321.5 ℃處。第一階段失重率為10.5%，為結(jié)晶失水過程；第二階段失重率為62.9%，為β-CD 的熱分解過程。對(duì)于ABP，TG 曲線顯示其在190.0 ℃前幾乎沒有質(zhì)量損失，而后隨著溫度的升高ABP 逐漸發(fā)生分解，在190.0～383.7 ℃溫度范圍內(nèi)，ABP的失重率為87.2%。ABP/β-CD 的包合物和物理混合物在溫度升至70.0 ℃時(shí)質(zhì)量均持續(xù)下降，但物理混合物的熱重?fù)p失速率顯著高于包合物，包合物的最終殘留質(zhì)量（8.0%） 顯著高于物理混合物（4.3%）。上述結(jié)果表明通過與β-CD 的包合，ABP的熱穩(wěn)定性得到了提高。

圖5 ABP（a）、β-CD（b）、ABP 與β-CD 物理混合物（c）和ABP/β-CD 包合物（d）TG 圖Fig.5 TG diagrams of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），physical mixture of adlay bran polyphenols and β-CD（c），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（d）

2.5 SEM 分析

ABP、β-CD 及其混合物和包合物的表面形貌觀察結(jié)果如圖6所示。ABP 為大小規(guī)則的針狀晶體結(jié)構(gòu)，表面光滑，而β-CD 則呈體積較大的不規(guī)則碎片狀。在二者的物理混合物中，兩種形態(tài)的顆粒結(jié)構(gòu)均能被觀察到，且分離明顯。而ABP/β-CD包合物則呈致密、均勻的片狀結(jié)構(gòu)，與ABP 和β-CD 在大小和形狀方面具有較大差異，這些結(jié)果進(jìn)一步表明包合物的形成[21]。當(dāng)ABP 與β-CD 形成包合物時(shí)，主、客體分子之間的相互作用導(dǎo)致其晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而引發(fā)包合物形貌發(fā)生了很大變化。Shao 等[25]在綠原酸和β-CD 形成復(fù)合物過程中也報(bào)道了顯著的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

圖6 ABP（a）、β-CD（b）、ABP 與β-CD 物理混合物（c）和ABP/β-CD 包合物（d）SEM 圖Fig.6 SEM photos of adlay bran polyphenols（a），β-CD（b），physical mixture of adlay bran polyphenols and β-CD（c），and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex（d）

2.6 抗氧化活性

多酚是植物體中的一大類重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，可清除自由基、鰲合金屬離子、淬滅單線態(tài)氧，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[28]。為了探討包合作用對(duì)ABP 抗氧化活性的影響，分別采用ABTS 和FRAP法比較了同一濃度下游離和絡(luò)合ABP 的抗氧化活性。其中，ABTS 法測(cè)量的是樣品對(duì)自由基的清除作用，而FRAP 法考察的是樣品的鐵離子還原能力[19]。如圖7所示，ABP 的ABTS 陽離子自由基清除能力和FRAP 分別為0.450 和0.303 mmol TE/L，而ABP/β-CD 包合物的ABTS 陽離子自由基清除能力和FRAP 分別為0.475 和0.330 mmol TE/L，分別較ABP 提高了5.6%和8.9%（P＜0.05）。β-CD 本身沒有任何抗氧化活性[14]，然而當(dāng)ABP 與β-CD 形成包合物時(shí)，β-CD 的仲羥基與ABP 芳香環(huán)上羥基之間形成的分子間氫鍵作用可能在一定程度上促進(jìn)了包合物抗氧化活性的提高[29-30]。與本研究類似，Chao 等[31]和Shao 等[25]的研究結(jié)果也表明與環(huán)糊精形成包合物后客體分子的抗氧化活性提高。

圖7 ABP 和ABP/β-CD 包合物抗氧化活性比較Fig.7 Comparison of the antioxidant activity between adlay bran polyphenols and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex

2.7 水溶液光照穩(wěn)定性

酚類物質(zhì)通常對(duì)外界環(huán)境條件敏感，尤其是在水溶液體系中，溫度、光照、pH 值等都會(huì)影響其穩(wěn)定性，因此在加工和儲(chǔ)存過程中容易發(fā)生降解[12]。Liu 等[20]研究表明兒茶素和表兒茶素溶液在pH 8.0 條件下儲(chǔ)藏48 h 損失率可分別達(dá)到21.2%和40.0%，而Zheng 等[32]研究發(fā)現(xiàn)楊梅多酚粉末在37 ℃，75%濕度條件下加速儲(chǔ)藏6 周后總酚損失率可達(dá)到88.61%。目前，包括微膠囊在內(nèi)的多種技術(shù)已被應(yīng)用于酚類物質(zhì)穩(wěn)定性的提高[33]。光照條件下ABP 和ABP/β-CD 包合物水溶液總酚保留率的動(dòng)態(tài)變化如圖8所示。光照對(duì)ABP 的穩(wěn)定性有很大的影響，隨著光照時(shí)間的延長ABP 逐漸降解，48 h 后，在客體ABP 中總酚保留率僅為79.0%，而在ABP/β-CD 包合物中總酚保留率達(dá)到了95.0%，是客體ABP 的1.20 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，β-CD 包合處理可顯著提高ABP 的光穩(wěn)定性。這主要是由于β-CD 具有梯狀空心椎體結(jié)構(gòu)，可通過非共價(jià)鍵與包括香料、精油和抗氧化劑在內(nèi)的多種物質(zhì)形成包合物，進(jìn)而為客體物質(zhì)提供保護(hù)作用[34]。類似地，Li 等[18]也報(bào)告了用β-CD 包合處理后桑椹多酚的光穩(wěn)定性有所提高。

圖8 ABP 和ABP/β-CD 包合物光照穩(wěn)定性比較Fig.8 Comparison of the light stability between adlay bran polyphenols and adlay bran polyphenols/β-CD inclusion complex

3 結(jié)論

采用冷凍干燥法制備ABP/β-CD 包合物。利用XRD、FTIR、TG-DSC、SEM 等分析方法對(duì)ABP/β-CD 包合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。與未包合前的ABP 相比，ABP/β-CD 包合物的ABTS 陽離子自由基清除能力提高了5.6%（P＜0.05），F(xiàn)RAP 增大了8.9%（P＜0.05）。水溶液光照穩(wěn)定性試驗(yàn)表明：隨著光照時(shí)間的延長，ABP 會(huì)逐漸發(fā)生降解，48 h 后，ABP/β-CD 包合物的總酚保留率是客體ABP 的1.20 倍（P＜0.05）。ABP/β-CD 包合物具有良好的熱穩(wěn)定性、抗氧化活性和水溶液光照穩(wěn)定性，可作為功能性食品的原料。