宋新強, 任雨軒, 張 玉, 何歡歡, 范金克, 趙麗君， 朱曉雯，彭 濤

(1. 信陽師范學院 a. 生命科學學院; b. 醫(yī)學院, 河南 信陽 464000; 2. 河南中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院， 河南 鄭州 450003)

0 引言

恰當?shù)馗兄車氖澜鐚θ祟惖男腋Ｖ陵P重要。從避免吃變質的食物、看到和聽到一輛駛來的汽車，到聞到漏氣的氣味或者感受到爐子燃燒的灼熱，感官協(xié)同工作來維持人類的生命。因此，揭示支撐人類感官的分子和細胞機制的研究多次引起諾貝爾生理學或醫(yī)學委員會的注意。聽覺(1961年)、視覺(1967年)和嗅覺(2004年)等感受器，此前都已得到認可。2021年，因為發(fā)現(xiàn)了能夠檢測溫度和觸覺的受體,所以諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了David JULIUS(戴維·朱利葉斯)博士和Ardem PATAPOUTIAN(阿德姆·帕塔普蒂安)博士兩位科學家。

他們工作的起源可以追溯到另一對諾貝爾獎獲得者。1944年，ERLANGER博士和GASSER博士因在不同類型的周圍神經纖維中形成動作電位的工作而獲得諾貝爾獎。他們描述的外周神經元負責傳遞疼痛感，神經細胞是高度特化的細胞，可以識別和傳遞不同類別的刺激信號，使機體精確感知外周環(huán)境。比如: 通過指尖能夠區(qū)分物體表面紋理的細微差別，也能分辨出令人舒適的和不適的熱度。

然而，這個感知過程中有一個基本問題還沒有答案: 溫度和機械刺激如何轉換為神經系統(tǒng)的電信號? 神經沖動究竟是如何產生從而讓機體感受到溫度和壓力的? 這正是今年獲獎的科學家們深度解答的問題。

1 發(fā)現(xiàn)溫度感受器

機體對外界信息的感受，通過外周感覺神經元傳入到脊髓和大腦。感覺這些不同刺激的神經元位于背根神經節(jié)(dorsal root ganglion, DRG) 和三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion, TG)，分別傳導身體和頭面部對溫度、機械力、化學物質等多種刺激的感覺信息。根據(jù)所檢測到的環(huán)境刺激，DRG神經元在功能上分為本體感受器、低閾值機械感受器和感知疼痛或溫度的細胞[1]。其中，大部分感知溫度的神經元也是傷害性感受神經元，可以通過對過熱或過冷刺激的傷害性感受，保護機體免受傷害。本體感覺神經元和低閾值機械敏感神經元的外周分支在骨骼肌和皮膚等特殊器官中終止，而溫度和痛覺神經元的軸突到達皮膚的表皮和真皮層并作為自由神經末梢(圖1)。

注：a. 由傳入(感覺)和傳出(運動)神經根連接形成的脊神經為皮膚、骨骼肌、內臟和腺體提供周圍神經支配。箭頭表示傳入感覺和傳出脈沖的方向。運動神經元的胞體位于脊髓的腹角內。感覺神經元的胞體位于背根神經節(jié)(DRG)。DRG內有感覺神經元亞類，如本體感覺神經元(藍色)、低閾值機械感覺神經元(紅色)和溫度和痛覺感覺神經元(綠色)。這些神經元集中投射到背角中間神經元，并向外周投射到靶組織。本體感覺神經元(藍色纖維)投射到靶組織內的特殊結構，如肌肉，并感覺肌肉拉伸。b. 低閾值機械感覺神經元(紅纖維)投射到傳遞機械刺激的末端器官。溫度和痛覺感覺神經元(綠色)不會投射到特定的末端器官；相反，它們作為游離神經末梢終止于皮膚各層，以及血管和毛囊附近。

人們在吃辣椒時，除了感覺辣以外，為什么常常會伴隨著灼熱，甚至是疼痛的感覺？19 世紀中葉已經有人第一次將辣椒素從辣椒粉中分離出來并命名為辣椒素(capsaicin)。1919 年，NELSON 報道了辣椒素的化學結構。20世紀90年代，JULIUS試圖通過利用辣椒素來回答這個問題。

JULIUS和他的同事[2]在加利福尼亞大學利用背根神經節(jié)(DRG)細胞，從中提取信使RNA，并構建了一個包含數(shù)百萬個片段的cDNA 文庫，認為在能夠感知疼痛、熱和觸覺的DRG 細胞的cDNA 文庫里，應當包含著可以編碼辣椒素受體的 DNA 片段。然后將這個cDNA 文庫劃分成不同的組別，每組大約包含16 000 個基因，依次將這些組的表達克隆瞬時轉染到原本不能對辣椒素產生反應的人胚胎腎細胞(human embryonic kidney 293 cell，HEK293)中，并利用鈣離子敏感的熒光染料進行功能篩選。如果含有辣椒素受體的cDNA文庫被轉入細胞，那么這些細胞就能對辣椒素產生反應。實驗確定出在辣椒素刺激下細胞內鈣離子濃度顯著升高的單個陽性克隆，并將對應的受體命名為香草酸受體亞型 1(vanilloid receptor subtype1, VR1)，也稱為辣椒素受體。JULIUS 最終確定的這個辣椒素敏感基因，編碼一種新的離子通道蛋白，后來被命名為TRPV1。讓人驚奇的是，TRPV1不僅能被辣椒素激活，同時也可以被43 ℃以上的高溫激活，所以也稱熱受體。這一發(fā)現(xiàn)，首次揭示了離子通道在物理和化學信號之間的共同轉導作用，即辣椒素等化學物質刺激與溫度等物理刺激，可通過細胞膜上TRPV1蛋白通道轉化為統(tǒng)一的電信號[3]，從分子層面揭示了軀體感受認知的最本質來源(見圖2[2，4])。

注： a. 使用鈣成像技術克隆辣椒素受體。用嚙齒動物背根神經節(jié)(DRG) cDNA文庫瞬時轉染HEK293細胞，用辣椒素(capsaicin)處理前(左)和處理期間(右)的克隆池進行顯微鏡熒光鈣成像。單獨轉染載體(pCDNA3的細胞對辣椒素無反應。轉染了第11個文庫的細胞中，有細胞質鈣含量顯著增加現(xiàn)象(中間，箭頭)。該池被反復細分和重新測定，直到分離出單個陽性克隆(VR1)(底部)。b. 在表達 VR1 的卵母細胞中對辣椒素和來自4種辣椒提取物的反應。右下角，繪制了每種辣椒提取物的相對效力。每個細胞的值被歸一化為用辣椒素獲得的反應。提取物在注水細胞中沒有引起任何反應。不同辣椒品種已報道的辣度(史高維爾單位)如下：哈瓦那辣椒(Habanero，H)100 000～300 000；泰式青椒(T)50 000～100 000；熱蠟辣椒(W)5 000～10 000和波布拉諾辣椒(P)1 000～1 500，辣椒素(C)的額定值為16×106 單位。c. 香草酸受體的表達僅限于感覺神經元。Northern雜交分析顯示VR1轉錄本僅限于感覺神經節(jié)。從成年大鼠制備Poly(A)+ RNAs，但DRG-P1樣品除外，該樣品是從新生幼鼠的背根神經節(jié)分離的。d. 原位雜交檢測感覺神經節(jié)細胞亞群中VR1的表達。用地高辛標記的VR1衍生反義核苷酸探針檢測成年大鼠背根神經節(jié)(DRG)和三叉神經節(jié)(TG)。陽性染色(紫色)僅限于直徑較小的細胞體(箭頭)，而在直徑較大的細胞體(箭頭)中不存在。e. VR1被有害的熱刺激激活。瞬時轉染VR1而非單獨載體(pcDNA3)的HEK293細胞，在受熱時表現(xiàn)出細胞質游離鈣顯著增加。f. 利用辣椒素鑒定出一種可被熱痛激活的離子通道蛋白，即辣椒素受體TRPV1。其他的相關離子通道蛋白TRPM8、TRPM3、TRPA1、TRPM2相繼被鑒定出，解釋了不同的溫度如何誘導神經細胞產生不同的電信號。

TRPV1 受體的發(fā)現(xiàn)，不僅解釋了辣椒素激活傷害性感受神經元的原理，也為更多溫度敏感型受體的發(fā)現(xiàn)提供了思路。2002 年，JULIUS 團隊[5]繼續(xù)用表達克隆的方法，在TG找到了對薄荷醇(menthol)和8～28 ℃溫度刺激敏感的冷覺受體(cold and menthol-sensitive receptor, CMR1)。同時，PATAPOUTIAN 團隊[6]基于模型預測和分子克隆技術也發(fā)現(xiàn)了這一受體，并將其命名為TRPM8受體。而TRPA1對寒冷敏感，能感知辣根、大蒜和芥末[7]。此后，人們發(fā)現(xiàn)TRP通道支持自然界的多種感官功能，例如，一些蛇使用TRPA1直系同源物作為紅外探測器，而駱駝和一些地松鼠進化出了TRPV1變體，使它們能夠承受顯著升高的環(huán)境溫度[8]，逐漸完善了機體對溫度感受的外周機制(見圖3)。

注： a. 溫度激活的瞬時受體電位離子通道，以及不同的溫度敏感型感覺神經元。b. 表達外源TRPM8通道蛋白的CHO細胞通過細胞內鈣濃度增加來響應低溫刺激。RPM8 穩(wěn)定轉染 CHO 細胞和未轉染 RPM8 的CHO 細胞，用熒光顯微鏡觀察。加上15 ℃冷刺激(通過微型熱電偶在細胞室內測量)，熒光增加，表明細胞內Ca2+在表達TRPM8的細胞中增加。增加細胞內Ca2+通過顏色的變化(藍-綠-黃-紅)來表示。最高水平的鈣濃度用紅色表示。c. 表達外源 TRPM8 通道蛋白的CHO細胞通過細胞內鈣濃度增加來響應薄荷醇刺激。

表達 TRPM8 的細胞，25 ℃時，細胞對薄荷醇有反應。鈣成像實驗的代表性圖像表明，在薄荷醇(menthol)刺激下，大量鈣的流入。這種反應在未轉染 TRPM8 的CHO細胞或沒有細胞外鈣的細胞中未見。

2 發(fā)現(xiàn)觸覺感受器

TRP家族中溫度感受器被不斷發(fā)現(xiàn)，解析了脊椎動物對外界溫度刺激的響應機制。但是感知領域當中另外一個關鍵問題，即如何將機械刺激轉化為觸覺、機械壓力感覺的分子機制還未解答。

在 JULIUS 首次描述TRPV1十年后，PATAPOUTIAN在斯克里普斯研究所(美國加利福尼亞州拉霍拉市)的同事們[9]開始了一個類似的旅程，以確定使神經元能夠對物理觸摸做出反應的機械傳感器。為了尋找參與機械轉導的蛋白質，篩選了幾種小鼠和大鼠細胞系(Neuro2A，C2C12，NIH/3T3，Min-6、50B11，F(xiàn)11，PC12)，通過壓力驅動的玻璃探針對細胞表面施加壓力，同時在另一個移液器處檢測和記錄電壓信號(圖4)。

圖4 細胞對機械力刺激的反應[9-10，13]Fig. 4 Cellular response to mechanical force stimulation

最后發(fā)現(xiàn)膠質瘤細胞系(Neuro2A，N2A)，當被微針這種機械力刺激時，它會釋放出可檢測到的電信號。推測這個可被機械力激活的受體是一種離子通道蛋白。利用RNA profiling 技術，確定了500多個候選基因，在測試了72個候選基因后，發(fā)現(xiàn)Fam38A 基因的敲除導致機械激活電流的顯著降低。將這個機械敏感的離子通Fam38A基因命名為PIEZO1——在希臘語中意為“壓力”[10]。根據(jù)與PIEZO1 的相似性，PATAPOUTIAN 又發(fā)現(xiàn)了第二個壓力敏感離子通道基因，命名為PIEZO2[11-12]。PATAPOUTIAN 通過對機械力(mechanical force)刺激敏感的細胞系進行基因敲除和篩選，發(fā)現(xiàn)被機械力激活的離子通道蛋白PIEZO1 和 PIEZO2；這種離子通道在許多生理過程和疾病狀態(tài)中都起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，PIEZO 受體參與多種生理和病理過程，如PIEZO1 受體與心肌細胞收縮、骨的生成和重塑、腫瘤細胞遷移等密切相關[10-14]；PIEZO2 受體直接參與介導觸覺、本體感覺、血壓、呼吸以及膀胱控制等[13-15]。

3 受體發(fā)現(xiàn)的意義

JULIUS 和PATAPOUTIAN 兩位科學家對熱受體(TRPV1)、冷受體(TRPV8)和機械壓力受體(PIEZO)的突破性發(fā)現(xiàn)，深入揭示了冷熱和機械力刺激如何導致神經沖動的產生，為人類理解感覺、知覺與其他生理病理活動奠定了基礎。

早在1969 年，科學家[16]發(fā)現(xiàn)了一種光感知缺陷的果蠅突變體，當暴露在持續(xù)光照下時，它只表現(xiàn)出短暫的特異性胞內鈣離子濃度升高。后來發(fā)現(xiàn)，這是由于離子通道編碼基因的功能拷貝缺失造成的，該基因被命名為TRP，即瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)。1997 年，JULIUS 團隊[2]發(fā)現(xiàn)TRP家族成員TRPV1 既是辣椒素的受體，又可以被高溫激活，從而鑒定出第一個溫度感受器。隨后又通過冷凍電鏡解析出TRPV1受體的結構[17-18]，為針對TRPV1 受體的藥物研發(fā)提供了依據(jù)。辣椒素受體TRPV1通道可作為鎮(zhèn)痛靶點，辣椒素脫敏具有明顯的治療潛力[19-20]。TRPV1 在無髓鞘類型的初級感覺神經元上表達。通過諸如辣椒素、熱H+及公認的內源性香草素等激動劑激活 TRPV1，觸發(fā)促炎性神經肽，如肽物質(SP)、降鈣素基因相關肽(CGRP)的釋放，從而啟動神經源性炎癥的生化級聯(lián)反應。同時，產生一種在大腦中被感知為疼痛或瘙癢的神經沖動。蛋白激酶C(PKC)和神經生長因子(NGF)降低了TRPV1(致敏)的激活閾值。用治療劑量的辣椒素刺激TRPV1可導致一種持續(xù)(長達數(shù)月)而且可逆的、對進一步的刺激毫無反應(沉默)的狀態(tài)，一般將這種現(xiàn)象稱為脫敏。高劑量辣椒素貼劑和特定部位注射可以通過這種機制減輕疼痛。治療劑量和超治療劑量的辣椒素分別導致可逆脫敏和不可逆神經毒性，兩者之間的界限尚不明確。盡管脫敏和神經毒性都依賴于辣椒素誘導的通過TRPV1通道的Ca2+內流，但下游的分子機制仍知之甚少。線粒體腫脹是辣椒素神經毒性的早期超微結構標志。Ca2+被認為是在線粒體中隔離的，在線粒體中它通過包括半胱天冬酶激活的分子途徑觸發(fā)細胞凋亡。鞘內注射樹脂毒素被用作“分子手術刀”，通過消融感覺神經元來實現(xiàn)慢性頑固性疼痛的癌癥患者的永久鎮(zhèn)痛(圖5)。事實上，高劑量辣椒素貼片和特異性部位注射已被臨床證明可以有效緩解骨關節(jié)炎、皰疹后神經痛和糖尿病多發(fā)性神經病患者的疼痛[21-25]。

圖5 疼痛途徑中的TRPV1：激動劑脫敏和拮抗劑阻斷的異同[21]Fig. 5 TRPV1 in the pain pathway: similarities and differences between agonist desensitization and antagonist blocking

辣椒素會引起強烈的初期疼痛反應，這也限制了患者的耐受劑量。為了減少這種副作用，人們開發(fā)了一些“非刺激性”TRPV1激動劑，如 olvanil (NE19550)[26]和MRD-652[22]，它們在受體的激活動力學上與辣椒素不同。這些化合物在動物疼痛模型中顯示出很好的前景，但它們的臨床價值還有待證實。

盡管PIEZOs在生理上和各種疾病中意義重大(見圖6),但其藥理作用不甚清楚。

注：a. 顯示了在小鼠模型中識別的PIEZO1(黑點)和PIEZO2(綠點)的不同表達模式和功能作用。突出展示了機械感覺器官中已確定的表型，而其他承受機械力的器官(如結腸、腸道和胃)的生物學功能尚未確定。b. 除了生理功能外，PIEZO相關疾病也在整個人體內出現(xiàn)。在心血管和軀體感覺障礙中分別發(fā)現(xiàn)了人類PIEZO1和PIEZO2的點突變。PIEZO依賴的機械轉導在各種癌癥中的潛在作用是一個新興的領域，目前發(fā)現(xiàn)的PIEZO1表達上調(黑色箭頭)強調了這一點。到目前為止，小細胞肺癌和非小細胞肺癌均顯示PIEZO1(黑色箭頭)和PIEZO2(綠色箭頭)表達下調。

PIEZO的突變可以導致功能喪失或者功能獲得。對于PIEZO1和PIEZO2的功能來說，既需要抑制劑，也需要激活劑?，F(xiàn)有的阻斷劑如釕紅、Gd3+和 GsMTx4 毒素肽對 PIEZOs 來說不是特異性的。雖然特異性化學激活劑 Yoda1和Jedi1/2已被確定用于 PIEZO1，但它們的作用是在微摩爾和亞毫摩爾范圍內觀察到的，不適合進一步的臨床研究。因此，需要開發(fā)新的高通量篩選技術，將分子神經科學、藥理學和生物物理學結合起來識別靶向 PIEZOs 的小分子。此外，毒素多肽、相互作用蛋白、內源性分子和多肽可以作為篩選調控 PIEZO功能的候選靶點。理想情況下，任何新發(fā)現(xiàn)的候選藥物都應該表現(xiàn)出對通道的高親和力，并且應該首先在體外測試其對細胞的毒性，然后在體內測試其臨床進展。PIEZO 的藥物發(fā)現(xiàn)是令人興奮，但也是一個非常具有挑戰(zhàn)性的途徑[27]。

鑒于PIEZO廣泛的表達模式，人們擔心PIEZO調節(jié)劑和治療藥物的脫靶效應。了解組織特異性影響和其他因素(如內源性分子)如何調節(jié)PIEZO通道的機械敏感性將有助于提高任何治療操作的特異性。此外，開發(fā)靶向藥物傳遞和基因治療方法將有利于PIEZO相關疾病的治療。通道活性喪失是遺傳疾病的致病因素，提供野生型PIEZOs的基因治療可能成為未來的治療選擇。有些病理不是由通道突變引起的，而是由基因表達改變引起的。可以采用創(chuàng)傷小的方法(如超聲和磁遺傳學)結合組織/器官特異性的原理，來操縱轉錄因子和PIEZO表達。此外，組織特異性PIEZO相互作用的蛋白也可以進行靶向修改其功能。STOML3就是這樣一個例子[28]，因為它已經被證明可以使PIEZO的反應敏感，而小分子靶向STOML3，逆轉了小鼠神經性疼痛驅動的行為。

4 展望

熱受體(TRPV1) 、冷受體(TRPM8) 和機械壓力受體(PIEZO)的突破性發(fā)現(xiàn),幫助科學家解答了長期困擾人們的謎題，即冷、熱和機械壓力是如何導致神經沖動的產生。TRP通道是機體感知溫度的關鍵，PIEZO通道賦予人體觸覺和本體感覺，此外，二者還在其他許多與感受溫度和機械刺激有關的重要生理過程中起關鍵作用。這些研究成果正在應用于慢性疼痛等多種疾病治療手段的研發(fā)中。JULIUS 和PATAPOUTIAN在溫度和壓力感受器方向的成就，是神經科學研究中(特別是離子通道方面)優(yōu)秀科學家的典范。他們的工作，將推動生理和病理條件下溫覺、冷覺、觸覺等感覺系統(tǒng)的功能研究,能激發(fā)更多年輕人投身到神經科學領域研究的熱情，去揭示生活中的自然規(guī)律，研制出更多更好的治療神經系統(tǒng)疾病的藥物，為人類健康服務。