王海波，陶貝貝，吳寧寧，毛安麗，張紅定

(信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院/信陽市功能納米材料生物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 信陽 464000)

0 引言

4-硝基苯酚(4-NP)是一種重要的硝基芳香化合物，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、炸藥、染料和制藥工業(yè)等領(lǐng)域。然而，4-NP也是一種難降解的環(huán)境污染物和有害廢物，對人類健康會造成嚴(yán)重威脅，引發(fā)惡心、頭痛、高鐵血紅蛋白血癥、腎臟和肝臟損害等多種疾病。由于4-NP的毒性和潛在致癌性，美國環(huán)境保護(hù)署已將其列入“優(yōu)先污染物清單”，并限定飲用水中最大允許濃度為0.43 μmol/L[1]。此外，它已被確定為危險的食物鏈污染物，可以殘留在農(nóng)作物、蔬菜、水果中。由于其穩(wěn)定性高、生物降解性差，去除污染的廢水和土壤中的4-NP仍然非常困難。因此，開發(fā)一種快速、高靈敏的4-NP檢測方法顯得至關(guān)重要。目前，許多分析方法已用于4-NP含量的檢測，如分光光度法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、電化學(xué)方法[4]、化學(xué)發(fā)光法[5]。但是，其中絕大部分方法處理時間長，需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作程序。相比之下，熒光分析方法具有樣品預(yù)處理簡單、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為4-NP的檢測提供了新的思路[6-8]。然而，大多數(shù)熒光方法是基于電子轉(zhuǎn)移(ET)或F?rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)誘導(dǎo)熒光猝滅機(jī)制[9-10]。為了實(shí)現(xiàn)對4-NP的靈敏檢測，需對熒光供體(熒光基團(tuán))和受體(4-NP)進(jìn)行表面修飾和化學(xué)偶聯(lián)，其中ET或FRET誘導(dǎo)的熒光猝滅效率依賴于供體和受體之間的距離。此外，4-NP的同分異構(gòu)體(2-NP和3-NP)由于化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，所以會對4-NP的選擇性檢測造成干擾。

基于內(nèi)濾效應(yīng)(IFE)誘導(dǎo)熒光猝滅構(gòu)建的傳感方法,具有操作簡單、靈活等優(yōu)點(diǎn)，而且吸收體和熒光團(tuán)之間不需要任何表面改性和共價連接。只要選擇適當(dāng)?shù)奈阵w和熒光基團(tuán)，當(dāng)吸收體的吸收光譜與熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜或發(fā)射光譜重疊時，IFE就可以有效地發(fā)生[11]。YANG等[7]以鋯基金屬有機(jī)骨架合成的碳點(diǎn)作為熒光探針，基于IFE實(shí)現(xiàn)了4-NP含量的靈敏檢測。ZHANG等[12]以蠟樣芽孢桿菌為唯一碳源，制備了熒光碳點(diǎn)，基于IFE用于4-NP的含量測定。但是，熒光碳點(diǎn)的合成過程繁雜，費(fèi)時費(fèi)力。熒光金屬納米團(tuán)簇作為一類新型的發(fā)光納米材料，具有毒性低、成本低、生物相容性好、發(fā)光性能優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。DNA-AuNCs通過熱輔助還原方法快速合成，并且具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和較高的光穩(wěn)定性。WANG等[15]利用DNA-AuNCs構(gòu)建了信號減弱型熒光傳感方法靈敏檢測胰蛋白酶活性。然而，利用DNA-AuNCs內(nèi)濾效應(yīng)構(gòu)建熒光方法的報道較少。

本文以DNA-AuNCs作為信號報告探針，設(shè)計(jì)了一種內(nèi)濾效應(yīng)誘導(dǎo)熒光猝滅的傳感新方法，用于靈敏檢測4-NP。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

4-NP、氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸鈉等試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。A30 DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列為：AAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA。

熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜采用熒光分光光度計(jì)(F7000，日本日立公司)進(jìn)行測量。熒光激發(fā)波長設(shè)置為290 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm。紫外吸收光譜采用紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(UH4150，日本日立公司)進(jìn)行測量，掃描范圍設(shè)置為200～600 nm。樣品池為石英比色皿，光程長為10 mm。

1.2 DNA-AuNCs的制備

DNA-AuNCs的制備采用熱輔助還原方法，以氯金酸作為原料，A30 DNA作為合成模板，檸檬酸鈉作為還原劑。首先，于1.5 mL離心管中，加入100 μL A30 DNA(2 μmol/L)、100 μL檸檬酸鈉(50 mmol/L，pH=6.0)、60 μL HAuCl4(1 mmol/L)和740 μL超純水，混合均勻。然后，將溶液置于90 ℃下孵育30 min，最后冷卻至室溫，即得到DNA-AuNCs，置于暗處4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 4-NP的檢測

準(zhǔn)確移取20 μL DNA-AuNCs、20 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.0)、10 μL不同濃度的4-NP、50 μL超純水，混合均勻，室溫下孵育5 min，然后進(jìn)行熒光光譜測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

基于DNA-AuNCs內(nèi)濾效應(yīng)誘導(dǎo)熒光猝滅傳感新方法的原理如圖1所示。

圖1 基于DNA-AuNCs內(nèi)濾效應(yīng)誘導(dǎo)熒光猝滅的傳感新方法原理圖Fig. 1 Schematic illustration for the DNA-AuNCs inner filter effect induced fluorescence quenching based novel fluorescent method

所制備的DNA-AuNCs在290 nm激發(fā)波長激發(fā)下，其最大發(fā)射波長為475 nm。4-NP在300～500 nm處具有較強(qiáng)的吸收，最大吸收峰位于400 nm。因此，4-NP的紫外吸收光譜與DNA-AuNCs熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均有部分重疊，發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，導(dǎo)致DNA-AuNCs的熒光信號被顯著地猝滅。通過熒光信號的變化，可以實(shí)現(xiàn)4-NP的定量檢測。

2.2 DNA-AuNCs的表征

DNA-AuNCs的形貌尺寸通過透射電子顯微鏡(TEM)來進(jìn)行表征。如圖2所示，DNA-AuNCs的形貌接近于球形，其尺寸為3.2±0.6 nm。圖3為DNA-AuNCs的熒光激發(fā)光譜(曲線a)、熒光發(fā)射光譜(曲線b)以及4-NP的紫外吸收光譜(曲線c)。DNA-AuNCs的最大激發(fā)波長為290 nm，最大發(fā)射波長為475 nm。4-NP的最大吸收峰為400 nm。4-NP的紫外吸收光譜與DNA-AuNCs熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均有部分重疊，能夠發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)。

圖2 DNA-AuNCs的TEM圖Fig. 2 TEM image of DNA-AuNCs

圖3 DNA-AuNCs的熒光激發(fā)光譜圖(a)和熒光發(fā)射光譜圖(b)、4-NP的紫外吸收光譜圖(c)Fig. 3 Fluorescence excitation (a) and emission spectra(b) of DNA-AuNCs, and UV-vis absorption spectrum(c) of 4-NP

2.3 熒光方法的可行性

考察了DNA-AuNCs在不同條件下的熒光發(fā)射光譜圖，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入200 μmol/L 4-NP后，DNA-AuNCs的475 nm處熒光強(qiáng)度顯著降低，該熒光方法可以用于對4-NP的檢測。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

考察了緩沖溶液的pH值和4-NP孵育時間對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示。4-NP存在時，DNA-AuNCs的熒光強(qiáng)度顯著降低，當(dāng)pH值為7.0時， 475 nm處熒光強(qiáng)度的差值最大。而且，一旦4-NP存在，熒光信號就顯著降低。

圖4 不存在(a)和存在(b)4-NP時，pH值對DNA-AuNCs熒光強(qiáng)度的影響Fig. 4 The effect of pH value on the FL intensity of DNA-AuNCs in the absence(a) and presence(b) of 4-NP

2.5 熒光方法定量檢測4-NP

在上述優(yōu)化的條件下，向DNA-AuNCs溶液中加入不同濃度的4-NP，構(gòu)建熒光傳感平臺。如圖5A所示，隨著4-NP濃度從0 μmol/L增加到600 μmol/L(0、1、10、20、30、50、60、80、100、150、200、400、500、600 μmol/L)，DNA-AuNCs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。圖5B給出了熒光響應(yīng)(F0-F，其中F0為無4-NP存在時的熒光響應(yīng)，F(xiàn)為有4-NP存在時的熒光響應(yīng))與4-NP的濃度(C，μmol/L)的相互關(guān)系。當(dāng)4-NP的濃度為1～80 μmol/L時，F(xiàn)0-F與C呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為F0-F=4.350 6+1.582 2C，相關(guān)性系數(shù)R=0.990 6，檢出限為0.3 μmol/L(RSN=3)。

圖5 不同濃度4-NP對應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖(A)和濃度校準(zhǔn)曲線(B)Fig. 5 Fluorescence emission spectra (A) of DNA-AuNCs in the presence of different concentrations of 4-NP and the calibration curve (B)

2.6 選擇性考察

2-硝基苯酚(2-NP)、3-硝基苯酚(3-NP)、抗壞血酸(AA)、EDTA、K+、Na+、Ca2+、Mg2+等作為潛在的干擾物質(zhì)來評估該傳感方法檢測4-NP的選擇性。如圖6所示，只有4-NP能夠?qū)е翫NA-AuNCs熒光信號顯著降低，這是由于4-NP的紫外吸收光譜與DNA-AuNCs熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均有重疊，發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)。其他干擾物質(zhì)(包括2-NP、3-NP)對DNA-AuNCs的熒光強(qiáng)度無顯著影響。結(jié)果表明，基于DNA-AuNCs內(nèi)濾效應(yīng)誘導(dǎo)熒光猝滅的傳感新方法檢測4-NP具有良好的選擇性。

圖6 傳感方法的選擇性考察Fig. 6 The selectivity of fluorescent method

2.7 實(shí)際樣品分析

將構(gòu)建的傳感方法應(yīng)用于湖水樣品中4-NP含量的測定。湖水樣品經(jīng)過離心(15 000 r/min)處理，收集上層清液。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對湖水樣品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果如表1所示，其加標(biāo)回收率為97.3%～102.8%，3次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不超過4.0%，表明該方法可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中的4-NP含量的測定。

表1 湖水樣品中4-NP含量的測定結(jié)果Tab. 1 Detection results of 4-NP content in lake water samples

3 結(jié)論

本文提出了一種基于DNA-AuNCs內(nèi)濾效應(yīng)誘導(dǎo)熒光猝滅的熒光傳感新方法，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和高選擇性檢測4-NP。該方法依賴于4-NP的紫外吸收光譜。該光譜與DNA-AuNCs熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均有重疊，發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，導(dǎo)致DNA-AuNCs的熒光信號顯著猝滅。這一方法在環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。