朱 濤,李芳菲,楊海涵,時 寧,李冰冰,王蓮哲

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 河南 平頂山 467000)

0 引言

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是真核生物中廣泛存在的一類功能蛋白因子，其通過與DNA的順式作用元件特異性結(jié)合來調(diào)控下游基因表達(dá)，參與生物體生長發(fā)育及環(huán)境脅迫響應(yīng)等眾多的生物學(xué)過程?；A(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix protein，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，因其主要由堿性氨基酸區(qū)和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)組成而命名[1]。植物基因組中bHLH多以基因家族形式存在，在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用[2]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子有保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，位于N末端的基本區(qū)域表現(xiàn)出DNA 結(jié)合活性，而兩個α-螺旋的HLH區(qū)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起作用[3]。由于可以同時與DNA和蛋白質(zhì)相互作用的雙重功能，bHLH轉(zhuǎn)錄因子對于植物生長調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)都非常重要，如葡萄VvbHLH1在擬南芥中的過量表達(dá)可以增強(qiáng)干旱和耐鹽性[4]。來自剛毛檉柳的bHLH基因過表達(dá)可以通過增強(qiáng)滲透勢和減少活性氧的積累來提高植物耐鹽性和耐旱性[5]。棉花中GhbHLH171過量表達(dá)通過激活茉莉酸(JA)合成提高植物對真菌V.dahlia的耐受性[6]。

山藥(Dioscoreaerhizoma)是典型的藥食兩用植物，深受人們喜愛，廣泛引起世人關(guān)注，多年來人們不斷對其營養(yǎng)價值、藥用價值進(jìn)行探索[7]。近年來，借助高通量測序及分子生物學(xué)技術(shù)，山藥中有多個基因被克隆，并初步分析了其在塊莖發(fā)育中的作用[8-10]，然而山藥中具有抗逆功能相關(guān)基因的研究還比較少。目前植物bHLH基因家族已開展了廣泛的鑒定及功能分析，而山藥中該研究未見報道。本研究在全基因組水平鑒定山藥bHLH基因家族，通過生物信息學(xué)及基因表達(dá)分析，揭示山藥bHLH基因的結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特點，及其對不同逆境脅迫的響應(yīng)功能。

1 材料與方法

1.1 山藥bHLH基因家族成員鑒定

山藥基因組信息在GenBank (http: //www. ncbi. nim.nih. gov /genbank/)數(shù)據(jù)庫中下載。以bHLH結(jié)構(gòu)域(PF00010)為查詢序列，利用HMMER 3.0軟件對山藥蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，獲得山藥bHLH家族蛋白序列，用保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗證，剔除不具備保守結(jié)構(gòu)的序列，并根據(jù)染色體定位進(jìn)行重新命名。使用ExPaSy數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org/tools/)進(jìn)行山藥bHLH的蛋白理化性質(zhì)分析。

1.2 山藥bHLH基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用Clustalx軟件進(jìn)行蛋白序列比對，MEGA 7軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測蛋白保守基序。用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因外顯子-內(nèi)含子模式圖。

1.4 染色體定位分析

根據(jù)基因信息通過Mapinspect軟件繪制染色體定位圖。

1.5 三維結(jié)構(gòu)分析

用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。

1.6 基因表達(dá)分析

分別取山藥根、匍匐莖和葉提取RNA，作為器官表達(dá)分析樣本。用體積分?jǐn)?shù)20% PEG 6000 溶液(模擬滲透脅迫)，200 mmol/L NaCl 溶液(模擬鹽脅迫)分別噴施3月齡山藥葉片，12 h 后取葉片提取樣本總RNA并反轉(zhuǎn)錄作為脅迫處理表達(dá)分析樣本。以網(wǎng)格蛋白重鏈基因(clathrin heavy chain,CHC)作內(nèi)參基因，引物CHC-F:5’-GGTGAACTGTATGAGGCGG-3’，CHC-R:5’-GCA-

TCCACACAAGCAAAGCA-3’。山藥bHLH5基因表達(dá)引物bHLH5-F: 5’-AACCAGCACGCACAAATACAC-3’，bHLH5-R:5’-TCAGATTCTGCAAAGCCTTCA-3’。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量，3次重復(fù)做統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

利用HMMER3.0軟件比對，并通過Pfam和SMART驗證保守結(jié)構(gòu)域，最后鑒定得到67個山藥bHLH基因。根據(jù)bHLH基因在染色體上的位置重新命名為bHLH01到bHLH67。

山藥bHLH成員蛋白序列理化性質(zhì)分析顯示，該家族氨基酸數(shù)目介于146 (DrbHLH65)至1097(DrbHLH22)之間，分子量大小為15.82(DrbHLH65)～121.52 kD(DrbHLH22)，等電點為4.77 (DrbHLH24)～10.06(DrbHLH65)。蛋白質(zhì)親疏水性分析表明，山藥bHLH家族蛋白屬于親水蛋白(表1)。

表1 山藥bHLH基因家族理化性質(zhì)分析Tab. 1 Physicochemical properties of yam bHLH gene family

續(xù)表1

2.2 山藥bHLH家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

對山藥和擬南芥bHLH蛋白序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。擬南芥bHLH 家族有21組[11]，山藥 bHLH 分為 17 組，沒有成員對應(yīng)擬南芥2、12、13和16組。其中成員數(shù)最多的是 15 組，有10 個成員，而第 21 組只包含一個山藥bHLH成員。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析還鑒定了山藥和擬南芥中的一些bHLH直系同源物，表明在這些植物物種分化之前存在一些祖先的 bHLH基因。

圖1 山藥和擬南芥bHLH蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of yam(Dr)and Arabidopsis thaliana (At) bHLH proteins

2.3 山藥bHLH基因家族保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

為了研究山藥bHLH基因家族的進(jìn)化關(guān)系，分析bHLH蛋白序列的保守基序及基因結(jié)構(gòu),結(jié)果見圖2。

圖2保守基序分析顯示，雖然67個山藥bHLH蛋白的保守基序在組成上存在差異，但都共同含有保守基序1，該基序是bHLH基因家族的保守結(jié)構(gòu)。此外，同組成員中有相似的保守基序組成，可能與該家族中某些特殊的功能有關(guān)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示只有5個基因(bHLH10、bHLH19、bHLH31、bHLH38 和bHLH57) 不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，其他bHLH基因均含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，且內(nèi)含子數(shù)目由1個(如bHLH47、bHLH60)到13個(bHLH8)不等。

2.4 山藥bHLH基因家族染色體定位

染色體定位分析顯示山藥67個bHLH基因除19、21號染色體外，分布在剩下的19條染色體上。其中在2號、7號、9號和20號染色體上只有1個成員；在8號染色體上分布較多，有11個成員。其他染色體上則有3～5個成員(圖3)。此外，1、4、8、13、16、18號染色體上有2個或多個基因的基因簇存在，可能是基因串聯(lián)復(fù)制的結(jié)果。

圖3 山藥bHLH基因家族染色體定位圖Fig. 3 Chromosomal location map of yam bHLH gene family

2.5 山藥bHLH蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

隨機(jī)挑選3個蛋白(DrbHLH5，DrbHLH50與DrbHLH65)進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)分析。圖4顯示3個蛋白均包含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，都包含4個螺旋，螺旋中間有至少2個環(huán)進(jìn)行連接，該結(jié)構(gòu)符合bHLH蛋白螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)模型。

圖4 山藥DrbHLH5、DrbHLH50與DrbHLH65蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig. 4 3D-structure of DrbHLH5, DrbHLH50 and DrbHLH65 proteins

2.6 山藥bHLH基因表達(dá)分析

為了分析bHLH基因潛在的功能，克隆得到了山藥DrbHLH5基因，該基因1 068 bp，編碼含355個氨基酸的蛋白。用qRT-PCR技術(shù)分析DrbHLH5基因表達(dá)模式。組織表達(dá)以山藥根中表達(dá)量設(shè)為1，其他器官以相對表達(dá)量顯示倍數(shù)差異，bHLH5在檢測的多個組織中都有表達(dá)，其中葉中表達(dá)量相對較高(圖5)。脅迫處理表達(dá)中以未做脅迫處理的空白對照表達(dá)量設(shè)為1，其他脅迫處理以相對表達(dá)量顯示，結(jié)果表明bHLH5在滲透脅迫下上調(diào)4倍以上，鹽脅迫處理下上調(diào)6倍左右(圖6)，暗示該基因可以響應(yīng)滲透脅迫和鹽脅迫，可能具有潛在的抗逆功能。

圖5 山藥bHLH5在不同器官中的表達(dá)Fig. 5 Gene relative expression of bHLH5 in different organs

圖6 山藥bHLH5在不同脅迫處理下的基因表達(dá)Fig. 6 Gene relative expression of bHLH5 under different stress treatments

3 討論

bHLH基因家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，因含有保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域而命名。植物bHLH基因家族成員數(shù)量多，許多已經(jīng)被鑒定。擬南芥和水稻分別有162和167個bHLH基因[12]。大豆、馬尾松中分別鑒定出340個和64個bHLH基因[13-14]。

理化性質(zhì)分析山藥bHLH基因家族蛋白都屬于親水蛋白，并具備bHLH保守結(jié)構(gòu)基序，符合bHLH轉(zhuǎn)錄因子的特征[1-2]。通過與擬南芥對比分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，可將山藥bHLH基因家族成員分為17個組，同一組內(nèi)的成員大都具有相同的基因結(jié)構(gòu)和保守基序，且bHLH基因內(nèi)含子數(shù)量差異較大，基因在染色體上的分布也不均勻，說明山藥bHLH基因家族進(jìn)化較為保守，基因簇可能源于串聯(lián)基因復(fù)制事件，且同組中有相似的結(jié)構(gòu)，暗示可能與特定的功能有關(guān)。此結(jié)果與甜橙bHLH基因家族分析結(jié)果相似[15]。

目前植物bHLH基因家族廣泛參與植物的多種生理活動，在生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)等方面具有重要的調(diào)控功能。甘藍(lán)BobHLH18基因在葉片高表達(dá)，且受冷脅迫誘導(dǎo)，可能在甘藍(lán)葉片應(yīng)答冷脅迫過程中起重要作用[16]。毛竹bHLH基因家族在干旱脅迫下有14個基因表達(dá)上調(diào)，鹽脅迫處理后有13個基因的表達(dá)量上調(diào)，表明其可能在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用[17]。本研究克隆得到山藥bHLH5，基因表達(dá)顯示其在山藥根、莖、葉中均有表達(dá)，且在滲透和高鹽脅迫下顯著上調(diào)，表明該基因可能具有抗非生物逆境脅迫的功能。該結(jié)果為下一步基因功能分析提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

由于山藥的基因功能研究起步較晚，目前，山藥bHLH基因家族成員的功能研究還很欠缺。本研究分析了鑒定了67個山藥bHLH基因家族成員，均屬于親水蛋白，三維結(jié)構(gòu)分析表明該家族成員具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，與其他植物中bHLH的結(jié)構(gòu)特征相符。67個bHLH基因可分為17組，同組的成員趨于擁有相同的保守基序和基因結(jié)構(gòu)，且基因在染色體上的分布不均勻，有些以基因簇存在?；虮磉_(dá)顯示山藥bHLH5基因可響應(yīng)干旱和鹽脅迫，下一步可以深入研究該基因的抗逆功能。研究結(jié)果為該基因家族的功能解析提供參考，對利用bHLH基因研究山藥基因功能，從而提高抗逆性及品質(zhì)改良提供依據(jù)。