王 輝， 劉合霞， 周興文,3， 譚肖玲， 韋曉曉， 李 博*

(1. 信陽農(nóng)林學院 林學院, 河南 信陽 464000； 2. 玉林師范學院 生物與制藥學院, 廣西 玉林 537000;3. 福建工程學院 建筑與城鄉(xiāng)規(guī)劃學院, 福建 福州 350118)

0 引言

金花茶(Camellianitidissima)為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)金花茶組植物，該植物主要分布在廣西西南部[1]。金花茶花型優(yōu)美，花色金黃，是山茶屬中較少具有黃色花的類群，具有較高的觀賞價值，是我國珍稀的園林觀賞植物[2]。類胡蘿卜素在植物中廣泛存在，具有促進植物花朵及果實顏色形成的作用[3]，ZHOU等[4]研究發(fā)現(xiàn)金花茶花瓣中含有新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、α-胡蘿卜素等多種類胡蘿卜素物質(zhì)；有學者認為類胡蘿卜素作為輔助色素促使金花茶花瓣顯黃色[5]。植物類胡蘿卜素主要通過類胡蘿卜素合成途徑合成，該合成途徑涉及多步酶促反應，其中番茄紅素β-環(huán)化酶 (Lycopene β-cyclases，LCYb)基因?qū)τ诖呋?胡蘿卜素的形成、調(diào)節(jié)含β-環(huán)的胡蘿卜素物質(zhì)合成、植物果實及花朵顏色的形成具有非常重要的作用[6]。

目前，已從擬南芥[7]、馬鈴薯[8]、柑橘[9]、枸杞[10]、番茄[11]、歐李[12]、萬壽菊[13]、黃秋葵[14]、桃[15]、雞爪槭[16]、矮牽牛[17]等植物中克隆獲得了LCYb基因，并且通過熒光定量PCR對LCYb基因在這些植物不同組織中的表達情況進行了定量研究。LCYb基因可調(diào)控萜類物質(zhì)合成，提高植物對非生物脅迫的抗性[18]。此外LCYb基因還可以調(diào)節(jié)類胡蘿卜素含量的積累，使番茄的果實[19]、西瓜[20]的果瓤、桂花[21](Osmanthusfragrans)的花朵、洋桔梗[22](Eustomagrandiflorum)的花瓣呈現(xiàn)不同的顏色。然而，金花茶LCYb基因的克隆鑒定，以及LCYb基因在金花茶中的表達情況尚未見報道，本研究以金花茶花瓣作為研究材料，利用同源克隆和RACE技術(shù)克隆了金花茶LCYb基因的全長序列，對LCYb基因序列進行生物信息學分析，并在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上研究了LCYb基因在金花茶開花過程中的表達模式，為闡明LCYb基因在金花茶花瓣中類胡蘿卜素的合成調(diào)控機制，以及調(diào)控花瓣顯黃色的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣的金花茶植株栽植于玉林師范學院苗圃。采集金花茶不同開花時期的花瓣，擦洗干凈后，放入液氮中進行速凍處理，隨后保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2 實驗方法

1.2.1 金花茶花瓣總RNA的提取及CnLCYb基因的克隆

首先利用天澤基因公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒(RN38-EASYspin Plus)提取金花茶花瓣的總RNA，隨后對金花茶總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得 cDNA模板。根據(jù)genbank已公布植物LCYb基因的保守序列，用 Primer 5.0 軟件設計簡并引物(表1)，并利用該對引物對金花茶LCYb基因進行PCR擴增，PCR反應程序如下：94 ℃條件下預變性，5 min；94 ℃變性，30 s；56 ℃退火，30 s；68 ℃延伸，50 s；共30個循環(huán)；最后68 ℃條件下，延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增獲得的產(chǎn)物，隨后回收目的片段(Axygen公司)，將目的片段連接在pGEM-Teasy Vector載體上(Promega公司)，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli DH5α, TaKaRa公司)，大腸桿菌在添加了氨芐西林(100 g/L)的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，利用藍白斑篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR鑒定陽性克隆，搖菌后將樣品送至華大基因生物公司進行測序。根據(jù)測序所得CnLCYb基因的保守序列，設計了金花茶LCYb基因的5’末端RACE引物LSP5’和3’末端RACE引物LSP3’，隨后使用RACE試劑盒克隆CnLCYb基因的3’末端、5’末端，連接pGEM-Teasy載體后寄送給華大基因生物公司進行基因測序。對金花茶LCYb基因的3’末端序列、5’末端序列以及保守片段進行拼接，主要參考周興文等的方法[4]，然后根據(jù)拼接完成的LCYb基因全長序列設計全長擴增引物(表1)，將全長擴增產(chǎn)物與載體進行連接，送至華大基因公司測序，從而獲得金花茶LCYb基因。

表1 金花茶 CnLCYb 基因克隆及載體構(gòu)建所用引物Tab. 1 Primers used in the cloning and expression vector construction of CnLCYb

1.2.2CnLCYb基因的生物信息學分析

首先，使用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)預測金花茶CnLCYb基因的開放閱讀框；隨后利用ExPASy在線網(wǎng)站預測金花茶CnLCYb基因的蛋白質(zhì)性質(zhì)；通過NCBI網(wǎng)站的blastp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp)進行同源性比對，獲取金花茶CnLCYb的同源基因；而LCYb蛋白亞細胞定位及二級結(jié)構(gòu)預測則通過Predict protein(https://www.pridecitprotein.org)在線網(wǎng)站完成；再利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對金花茶LCYb蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型進行預測。利用MEGA 10軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析LCYb同源基因的系統(tǒng)進化關(guān)系(Bootstrap=1 000)。

1.2.3CnLCYb的定量分析

利用Primer 5軟件設計CnLCYb基因的熒光定量PCR引物(表1)；利用18 S rRNA作為內(nèi)參基因進行熒光定量PCR反應，檢測LCYb基因在不同開花時期花瓣中的表達情況，每個樣品重復3次，采用 2-ΔΔCT法計算差異基因的相對表達量。金花茶的開花過程被劃分為幼蕾期(A)、初蕾期(B)、顯色期(C)、半開期(D)、盛開期(E)等5個階段，具體的劃分標準參考周興文等的研究[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶CnLCYb基因的克隆與序列分析

通過簡并引物對(JBS1/JBA2)，從金花茶花瓣的cDNA中擴增獲得長度約為700 bp的同源片段，隨后利用5’RACE引物(LSP5’)擴增獲得5’末端序列，利用3’RACE引物(LSP3’)擴增獲得3’末端序列，其長度分別為1 200 bp，1 000 bp；接著利用全長擴增引物對CZS1/CZA2進行PCR擴增，得到了長度為1 574 bp的全長序列(圖1)。

通過序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因的全長序列與電子拼接的結(jié)果相同，ORF Finder分析表明它的開放閱讀框長度為1 515 bp(見圖2)，共編碼504個氨基酸。

注: M.DNA Marker DL2000; A.CnLCYb保守區(qū)擴增產(chǎn)物; B.5’ RACE擴增產(chǎn)物; C.3’ RACE擴增產(chǎn)物; D.CnLCYb全長擴增產(chǎn)物

圖2 金花茶CnLCYb基因序列Fig. 2 Sequence of CnLCYb gene in Camellia nitidissima

2.2 金花茶CnLCYb編碼蛋白的特征分析

ExPASy分析結(jié)果顯示，CnLCYb蛋白含有影響蛋白質(zhì)酸堿性的氨基酸共116個，其中呈酸性的氨基酸有58個，主要由谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)組成，而呈堿性的氨基酸共有58個，則主要由賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)組成。CnLCYb蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)值為40.71，屬于不穩(wěn)定蛋白；另外，還發(fā)現(xiàn)該蛋白的親水指數(shù)為-0.153，具有親水性，而脂溶指數(shù)則為92.80。通過PSORT Prediction 在線網(wǎng)站對CnLCYb蛋白進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)CnLCYb定位在葉綠體上的可能性較大。Predict Protein在線網(wǎng)站預測結(jié)果顯示，CnLCYb蛋白的二級結(jié)構(gòu)域中無規(guī)則卷曲元件所占比例最多，約為42.86%；其次是α-螺旋元件，所占比例為37.1%；而β-折疊元件所占比例最低，只有4.96%，這與利用SWISS-MODEL對金花茶CnLCYb蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果基本相符(圖3)。

2.3 金花茶CnLCYb基因編碼蛋白質(zhì)的同源性比對及系統(tǒng)進化分析

在線分析表明，CnLCYb蛋白具有PLN02463(Accession:PLN02463)、Carotene-cycl(Accession:TIGR01790)、Lycopene_cycl(Accession:pfam05834)等保守結(jié)構(gòu)域，其中PLN02463結(jié)構(gòu)域的編碼氨基酸起止為60～504位，Carotene-cycl結(jié)構(gòu)域為89～484位，Lycopene_cycl則為89～484位，這些結(jié)構(gòu)域分別屬于NADB_Rossmann、Carotene-cycl、Lycopene_cycl超基因家族(圖4)，表明金花茶CnLCYb蛋白具有植物LCYb典型的保守區(qū)域。

圖4 金花茶CnLCYb蛋白功能結(jié)構(gòu)域預測Fig. 4 Prediting functional domain of CnLCYb protein in Camellia nitidissima

為解析金花茶CnLCYb蛋白與其他植物LCYb蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系，通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜尋，獲得了17條與金花茶CnLCYb蛋白相似性較高的氨基酸序列(Identity>85%)，隨后利用這些氨基酸序列與金花茶CnLCYb蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)，結(jié)果顯示金花茶CnLCYb蛋白與同為山茶科山茶屬的茶樹LCYb蛋白的親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)進化樹中它們被聚類于一個小分支內(nèi)；另外還發(fā)現(xiàn)金花茶CnLCYb蛋白與雜交杜鵑(Rhododendronkiusianum×Rhododendron indicum)、獼猴桃(Actinidiarufa)、柿子(Diospyroskaki)、油橄欖(Oleaeuropaeavar.sylvestris)等植物的LCYb也具有較高的相似性，而與雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、麻風樹(Jatrophacurcas)、木薯(Manihotesculenta)、毛果楊(Populustrichocarpa)的親緣關(guān)系最遠。

圖5 金花茶CnLCYb基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 5 Phylogenetic tree of CnLCYb gene in Camellia nitidissima

2.4 金花茶CnLCYb基因開花過程中的表達分析

通過對金花茶CnLCYb基因的熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)在金花茶開花的早期和中期，即從幼蕾期到顯色期，CnLCYb基因的表達量相對較低，CnLCYb基因主要在花朵開放的后期(即半開期和盛開期)表達量較高(見圖6)，研究結(jié)果表明在金花茶花朵開放進程中，CnLCYb基因在花瓣中的表達總體呈現(xiàn)上升的趨勢，并在花朵盛開期達到最大值。

注:A.幼蕾期; B.初蕾期; C.顯色期; D.半開期;E.盛開期

3 討論

植物中LCYb基因是一個大家族，不同類別植物的LCYb蛋白的氨基酸序列差異較大(Ronen et al., 1999)，它們序列長度主要處于1 650～1 900 bp之間，編碼序列長度范圍約為495～505個氨基酸，本研究中克隆獲得的金花茶CnLCYb基因全長序列為1 515 bp，編碼504個氨基酸，且該基因含有植物番茄紅素β-環(huán)化酶中特有的保守基序[23-24]，如LCYb conserved regions、a dinucleotide FAD/NAD-binding domain(DX4GXGXAX4A)、Cyclase motif I、Cyclase motif II以及帶電區(qū)域(A charged region)；另外，在系統(tǒng)進化分析中發(fā)現(xiàn)金花茶CnLCYb基因與同為山茶屬的茶樹LCYb基因的相似性最高，上述結(jié)果表明本研究的克隆分析結(jié)果客觀可信。

花是被子植物的基本特征之一，是有性生殖不可缺少的器官，其中花色在吸引傳粉者方面具有重要的作用[25,26]，而花色與植物所含色素有關(guān)，花色素主要包括類胡蘿卜素、花青素和甜菜素等3種[27]。 類胡蘿卜素是C40萜類化合物，廣泛存在于植物的質(zhì)體中，在光合作用、光損傷保護、激素合成中發(fā)揮重要的作用，也是花和水果中最重要的色素之一[28-29]。金花茶花瓣中含有新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、α-胡蘿卜素等多種類胡蘿卜素[4]，這些化合物可能作為輔助色素調(diào)控金花茶的花色。LCYb基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)類胡蘿卜素合成具有重要作用，但LCYb基因在不同花色的植物中的表達模式存在差異。例如，在栽培番茄(Solanumlycopersicum)、萬壽菊(Tageteserecta)品種‘V-01M’中，雖然栽培番茄的花色為橙黃色，萬壽菊品種‘V-01M’的花色呈黃色，但它們的LCYb基因表達模式和金花茶CnLCYb基因的表達模式類似，都表現(xiàn)為開花早期及中期LCYb基因中度表達，在花朵完全盛開之后表達量則有所提高，LCYb基因表達量呈現(xiàn)后期升高趨勢[30-31]。然而，在野生番茄(Solanumchilense)、黃杜鵑(Rhododendronmolle)、萬壽菊、水仙(Narcissuspseudonarcissus)等花朵呈黃色的植物中，LCYb基因在開花過程中的表達量逐步增高，但隨著花朵的完全開放，該基因的表達量則有所下降，LCYb的表達量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢[31-33]，這些植物中LCYb基因的表達模式與金花茶存在明顯不同。另外，還發(fā)現(xiàn)在花色呈白色的萬壽菊品種‘snowdrift’中，LCYb基因為中低度表達，在該植物的整個開花過程中LCYb基因不存在表達量的變化[34]。綜上所述，對LCYb基因在多種不同花色植物中的表達情況進行比較，發(fā)現(xiàn)在同為開黃色花的金花茶和萬壽菊品種‘V-01M’中LCYb基因具有類似的表達模式，因此，推測在調(diào)控花色的作用機制中這兩種植物的LCYb基因具有相同功能，但具體的分子作用機制仍有待驗證。

4 結(jié)論

利用同源克隆和RACE技術(shù)克隆得到了金花茶CnLCYb基因的全長序列，該基因開發(fā)閱讀框全長1 515 bp，共編碼504個氨基酸。熒光定量PCR分析表明，金花茶CnLCYb基因在花發(fā)育過程中表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，在盛花期表達量最高。本研究為后續(xù)深入研究CnLCYb基因功能提供了可操作基因，為深入研究CnLCYb基因調(diào)控金花茶花色的作用機理提供了一定的理論基礎。