梅凱 李鑫 李婷婷 郝逗逗 王靈敏 王昕怡 陳佳佳 劉葭 吳清

提取工藝作為制備中藥復(fù)方制劑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響制劑質(zhì)量及臨床療效，優(yōu)選提取工藝路線需要參考各藥味所含成分的理化性質(zhì)和藥理作用，并結(jié)合制劑工藝和大生產(chǎn)實際情況[1-2]。由于中藥具有多成分、多靶點的特點，設(shè)置多指標(biāo)及其評價成為了優(yōu)化中藥復(fù)方制劑的關(guān)鍵。模糊層次分析法(fuzzy analytic hierarchy process, FAHP)是將模糊層次法和層次分析法結(jié)合，將評價指標(biāo)和對象劃分為不同層次，同一層次的指標(biāo)通過兩兩比較重要程度，組成模糊矩陣，通過計算得到各評價指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[3-4]。本實驗以冰苓止癢噴霧為模型藥，研究模糊層次分析法在中藥提取工藝路線優(yōu)選中的應(yīng)用。

瘙癢是一種可以被機(jī)械、化學(xué)刺激所誘導(dǎo)的強(qiáng)烈搔抓欲望的感覺，也是糖尿病、膽汁淤積癥和艾滋病等系統(tǒng)性疾病的臨床表現(xiàn)[5-6]，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，13.5%的成人患有瘙癢癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，需要及時治療[7]。目前對瘙癢癥的治療還僅限于抗組胺藥，局部和全身糖皮質(zhì)激素或某些抗過敏藥、抗抑郁藥、抗癲癇藥的應(yīng)用，但有一定的副作用[8-10]。

復(fù)方土茯苓方是臨床上治療瘙癢的有效中藥復(fù)方，由土茯苓、徐長卿和防風(fēng)等藥味組成，共奏祛風(fēng)止癢，清熱利濕的功效。臨床應(yīng)用時為全方水提后外用，制備工藝簡單，但是有效成分利用率低，使用不方便。因此本論文對冰苓止癢方提取工藝進(jìn)行考察，以優(yōu)化制劑前處理方法。通過查閱方中各藥味的理化性質(zhì)和抗瘙癢作用的強(qiáng)弱，參考原制劑工藝的臨床應(yīng)用方式，設(shè)計兩條提取工藝路線，選擇化學(xué)指標(biāo)結(jié)合藥效學(xué)指標(biāo)作為評價指標(biāo)，通過模糊層次分析法賦權(quán)、確定各因素指標(biāo)合成權(quán)重，得到各工藝路線加權(quán)綜合得分，根據(jù)背部皮膚病理切片結(jié)果進(jìn)行驗證，優(yōu)選出最佳提取工藝路線。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

CP-7800C型剃毛器(科德士電子廠)；低速離心機(jī)[艾卡儀器設(shè)備(廣州)有限公司]; BH-2型光學(xué)顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(日本島津公司)；可變波長檢測器(日本島津公司)；INERTSIL ODS-3色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司)；BZF50型真空干燥箱(上海BOXUN公司)；BT 125D電子分析天平(北京賽多利斯公司)；電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；JY20002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司)；SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 實驗藥物與試劑

土茯苓(北京三和藥業(yè)有限公司，批號：11050301)；苦參(北京三和藥業(yè)有限公司，批號：10620301)；防風(fēng)(北京三和藥業(yè)有限公司，批號：103503101)；蒼耳子(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：200915009)；艾葉(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：210626006)；徐長卿(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：20190541)；落新婦苷(批號：J29GB153016)、丹皮酚(批號：L15D9D77791)、升麻素苷(批號：S25GB162330)，以上標(biāo)準(zhǔn)品含量≥98%，均購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜級，美國Sigma)；冰醋酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2021032040)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；4-氨基吡啶(Adamas-beta，批號：P1780631，用生理鹽水配成0.01%溶液)；生理鹽水(山東華魯制藥有限公司，批號：SD21010212)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：2107016S)；脫毛膏[利潔時家化(中國)有限公司]；小鼠組胺定量檢測試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購于泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠(23±2) g，雌雄各半, 斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.4 提取工藝路線設(shè)計

復(fù)方土茯苓方中君土茯苓臨床上用于多種皮膚病，包括足癬、濕疹和銀屑病等[11]。土茯苓中含有糖類、有機(jī)酸類、苯丙素類、黃酮和黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，其中黃酮及黃酮苷類包括黃杞苷、異黃杞苷、落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷等，而落新婦苷是土茯苓中關(guān)鍵的活性成分和質(zhì)量控制指標(biāo)成分，為二氫黃酮醇苷類化合物，《中華人民共和國藥典》中規(guī)定土茯苓按干燥品計算，落新婦苷含量不得少于0.45%，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等多種生物活性[12-15]，文獻(xiàn)報道落新婦苷能夠抑制白介素-6(interleukin- 6，IL- 6)、白介素-1β(interleukin- 1β，IL- 1β)的表達(dá)、乙酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，對代表性的腋窩皮膚菌群有抑制作用[16-17]。

臣藥徐長卿目前較多地應(yīng)用于皮膚類疾病，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。羅懷宇[18]發(fā)現(xiàn)含徐長卿提取液的牙膏樣品對急性炎癥具有明顯作用；徐長卿水煎劑可使小鼠扭體反應(yīng)潛伏期明顯延長，扭體次數(shù)明顯減少[19]。文獻(xiàn)報道和《中華人民共和國藥典》已明確徐長卿的主要有效成分為丹皮酚[13,20]，丹皮酚可緩解二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的癥狀[21]。臣藥防風(fēng)中的色原酮類成分，是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，防風(fēng)提取物及色原酮類單體成分均有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌作用[22]，《中華人民共和國藥典》也明確了升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷兩種色原酮成分為防風(fēng)的質(zhì)量控制指標(biāo)成分[13]。靜脈給藥防風(fēng)色原酮單體，發(fā)現(xiàn)對致熱大鼠和熱板致痛小鼠有較好的解熱鎮(zhèn)痛作用[23]，趙娟等[24]發(fā)現(xiàn)防風(fēng)色原酮提取物對大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率起到明顯的抑制作用。

君藥土茯苓主要活性成分落新婦苷、臣藥徐長卿主要活性成分丹皮酚和臣藥防風(fēng)主要活性成分升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷都具有水溶性差的特點，而其余三味中藥在方中占比小，能夠溶于乙醇，考慮到成本、時間等因素，故提取工藝路線一采用全方醇提，提取工藝路線二參考臨床用法，全方水提。

工藝路線一：(醇提組)稱取處方量的冰苓止癢方飲片，以8倍量70%乙醇為提取溶媒，回流提取2次，每次1小時，濾過，合并濾液，回收乙醇，濾液減壓濃縮至生藥量為1 g/mL(1∶1)，放冷后，備用。

工藝路線二：(水提組)稱取處方量的冰苓止癢方飲片，以8倍量水為提取溶媒，回流提取2次，每次1小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至生藥量為1 g/mL(1∶1)，放冷后，備用。

1.5 指標(biāo)性成分定量測定

1.5.1 不同提取工藝路線樣品制備 取一定處方生藥，按“1.4”項下提取并濃縮備用。

1.5.2 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量

(1)HPLC色譜條件：色譜柱為INERTSIL ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；以甲醇為流動相A，以0.1% 冰醋酸溶液為流動相B，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長：254 nm(升麻素苷)、291 nm(落新婦苷、丹皮酚)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按落新婦苷峰、丹皮酚峰、升麻素苷峰計算分別應(yīng)不低于5000、3000和2000。

表1 流動相梯度洗脫表

(2)對照品溶液配制：分別取落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷對照品適量, 精密稱定, 加甲醇共同制成質(zhì)量濃度分別為568.87 μg/mL、96.10 μg/mL、64.19 μg/mL的對照品溶液, 即得。

(3)樣品溶液制備：分別精密移取1 mL“2.1”項下提取液置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

(4)樣品測定：分別精密吸取對照品溶液10 μL, 樣品溶液10 μL, 注入高效液相色譜儀, 測定, 用外標(biāo)兩點法計算, 即得。計算落新婦苷含量(指標(biāo)A)、丹皮酚含量(指標(biāo)B)和升麻素苷含量(指標(biāo)C)。

1.6 藥效學(xué)實驗

皮膚瘙癢是機(jī)體自發(fā)或受外界影響產(chǎn)生的一種伴隨著刮擦行為或欲望的不愉快感覺，4-氨基吡啶具有促肥大細(xì)胞釋放組胺的作用，其所致小鼠瘙癢模型已被多次應(yīng)用于測定藥物止癢活性的實驗中[25]。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏是長效甾體類激素藥物，用于局限性搔癢癥、神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、脂溢性皮炎以及慢性濕疹。

1.6.1 實驗動物分組 SPF級ICR小鼠30只，雌雄各半,體質(zhì)量(23±2)g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度(50±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，雌雄各半隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、陽性藥組、醇提組、水提組。第4天在小鼠頸背部剪去2 cm×3 cm大小，再用脫毛劑脫毛，24小時后分別給藥：用藥組分別外涂冰苓止癢提取液適量于脫毛部位，模型組和空白組在脫毛區(qū)不作處理，陽性藥組外涂復(fù)方醋酸地塞米松乳膏適量。30分鐘后，每只小鼠頸背部皮下注射0.01% 4-氨基吡啶0.2 mL，空白組注射等量生理鹽水，將其置于攝像環(huán)境下的觀察籠位(50 cm×30 cm×15 cm，由隔板將其分割為6個獨立空間)，立即觀察10分鐘舔體次數(shù)(指標(biāo)D)(小鼠出現(xiàn)反復(fù)扭頭舔兩側(cè)背部的行為，即舔體反應(yīng)，以小鼠連續(xù)舔體致出現(xiàn)短暫停頓，作舔體1次計算)[26]。

1.6.2 制備藥物 按“2.1”項下各工藝路線制備每1 mL提取液含1 g生藥的藥物(臨床生藥濃度為0.86～1 g/mL)。

1.6.3 動物取材 小鼠的舔體次數(shù)記錄結(jié)束后立即取血，靜置至血液分層后以4000 r/分鐘的速度離心15分鐘分離血清，放置于-20 ℃保存待用，ELISA試劑盒測定小鼠血清中組胺的含量(指標(biāo)E)。犧牲小鼠后，取注射部位周圍皮膚(2 cm×2 cm)全層置于4%多聚甲醛固定液中保存，做石蠟切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色，觀察并比較皮膚組織有無明顯的形態(tài)學(xué)改變，觀察真皮中炎細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化[26]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

1.8 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化采用最小—最大標(biāo)準(zhǔn)化處理。對于指標(biāo)A、B、C，若值越大，則目標(biāo)值越優(yōu)，新數(shù)據(jù)=(原數(shù)據(jù)-最小值)/(最大值-最小值)。對于指標(biāo)D、E，若值越小，則目標(biāo)值越優(yōu)，新數(shù)據(jù)=(最大值-原數(shù)據(jù))/(最大值-最小值)。

1.9 模糊層次分析法為方案層賦權(quán)

1.9.1 構(gòu)造評價指標(biāo)層次模型 本實驗將評價系統(tǒng)設(shè)計為3層，分別為目標(biāo)層(1級指標(biāo)，即冰苓止癢噴霧提取工藝路線篩選)、準(zhǔn)則層(2級指標(biāo)，包括化學(xué)指標(biāo)和藥效學(xué)指標(biāo))和方案層(3級指標(biāo)，包括落新婦苷含量、丹皮酚含量、升麻素苷含量、舔體次數(shù)和組胺濃度)。

1.9.2 構(gòu)造模糊互補(bǔ)判斷矩陣 各指標(biāo)成分的評分標(biāo)度見表2。比較同一層次指標(biāo)的相對重要性，構(gòu)成兩兩比較模糊互補(bǔ)判斷矩陣。

別呦呦沒鹽了，給了我錢，讓我去買，那天逢集，人擠人，一隊胡人卻從街頭疾馳而來。胡人高舉長矛，矛尖上挑著血淋淋的首級，有一顆，有兩顆，還有人把首級掛在腰帶上。人們爭相避讓，避不及的，就被馬踢翻，后面的馬跟上來，就把他踩死了，幾十匹馬風(fēng)一般掠過，死者都沒人形了。街上哭聲罵聲一片。一個老奶奶是來賣雞蛋的，一籃子雞蛋全打了，她沒哭一聲，只有一頭白發(fā)在秋風(fēng)中狂舞；一個賣青菜的中年人就沒這么幸運了，他被馬踩死了，青菜被人搶光了，只有扁擔(dān)孤零零地伴著他……

表2 評分?jǐn)?shù)量標(biāo)度

1.9.3 構(gòu)造模糊一致矩陣 根據(jù)公式(1)(2)轉(zhuǎn)變?yōu)槟：恢戮仃嘡’=(γij)n*n，根據(jù)得到的模糊一致矩陣和公式(3)，計算各3級指標(biāo)權(quán)重，得到模糊一致矩陣。

1.9.4 一致性檢驗 若矩陣檢驗滿足任意指定兩行所對應(yīng)元素之差為常數(shù)，則該矩陣為模糊一致矩陣。

2 結(jié)果

2.1 HPLC含量測定

采用HPLC法測定指標(biāo)性成分落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量的結(jié)果見表3。

表3 指標(biāo)性成分落新婦苷、丹皮酚和 升麻素苷含量(μg/mL，n=2)

2.2 小鼠瘙癢試驗

2.2.1 小鼠舔體次數(shù) 10分鐘內(nèi)小鼠舔體次數(shù)的結(jié)果見表4?？瞻捉M、水提組、醇提組和陽性藥組與模型組相比，均能顯著降低舔體的次數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型造模成功，復(fù)方土茯苓方和陽性藥對于4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型有一定的抑制作用，其中水提組、醇提組與陽性藥組之間相比，均無顯著性差異。

表4 不同給藥組對小鼠瘙癢舔體次數(shù)的影響

2.2.2 ELISA檢測血清中組胺含量 在4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型中，組胺是介導(dǎo)瘙癢發(fā)生的關(guān)鍵性介質(zhì)，具有促肥大細(xì)胞釋放組胺的作用。如表5所示，與模型組相比，空白組小鼠血清中的組胺濃度顯著降低，說明瘙癢模型造模成功。與模型組相比，水提組、醇提組和陽性藥組小鼠血清中的組胺濃度均顯著降低，其中，醇提組的組胺濃度降低最為顯著，說明醇提組和水提組對4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型的血清組胺濃度均有一定的降低作用，相比于水提組，醇提組效果更優(yōu)。

表5 不同給藥組對小鼠血清組胺濃度的影響

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性藥組；D醇提組；E水提組(A、C黃色箭頭表示毛囊，紅色箭頭表示皮脂腺，黑色箭頭表示膠原纖維；B藍(lán)色箭頭代表壞死細(xì)胞，綠色箭頭代表新生血管，黑色箭頭代表炎癥細(xì)胞浸潤；D、E藍(lán)色箭頭代表壞死細(xì)胞)。

2.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

最小—最大標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)

2.4 模糊層次分析法為方案層賦權(quán)

2.4.1 構(gòu)造模糊互補(bǔ)判斷矩陣 模糊互補(bǔ)判斷矩陣見表7。

表7 模糊互補(bǔ)判斷矩陣

2.4.2 構(gòu)造模糊一致矩陣 3級指標(biāo)的模糊一致矩陣及權(quán)重見表8。由表8可知，權(quán)重由高到低依次為舔體次數(shù)>組胺濃度>落新婦苷含量>丹皮酚含量=升麻素苷含量。

表8 模糊一致矩陣

2.4.3 一致性檢驗 結(jié)果表明，對任意指定的2行其所對應(yīng)元素之差為常數(shù)，該矩陣滿足一致性檢驗。

2.5 各因素指標(biāo)合成權(quán)重的確定

將準(zhǔn)則層與3級指標(biāo)權(quán)重相乘，得到各因素相對于總評價目標(biāo)的總權(quán)重，在冰苓止癢噴霧提取工藝路線篩選中，藥效學(xué)指標(biāo)比化學(xué)成分含量更能代表工藝路線的有效性，故選擇藥效學(xué)指標(biāo)權(quán)重為0.7，指標(biāo)性成分定量測定占權(quán)重0.3。結(jié)果見表9。

表9 合成權(quán)重及排序

2.6 各工藝路線加權(quán)綜合得分及排序

結(jié)果表明工藝路線一為綜合評價優(yōu)選的最佳提取工藝路線，即全方醇提。結(jié)果見表10。

表10 各工藝路線加權(quán)綜合得分及排序

3 討論

本實驗采用4-氨基吡啶誘導(dǎo)小鼠瘙癢模型，在化學(xué)指標(biāo)上，選取與臨床療效相關(guān)的活性成分：新婦苷(君藥成分)、丹皮酚(臣藥成分)和升麻素苷(君藥成分)作為代表冰苓止癢噴霧的有效成分指標(biāo)，在藥效學(xué)指標(biāo)上[25]，選取小鼠舔體次數(shù)、血清組胺濃度作為篩選提取工藝路線的指標(biāo)。結(jié)果表明，落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量高低順序為工藝一>工藝二，而舔體次數(shù)和組胺濃度高低順序為工藝一<工藝二?；贔AHP得到的評分高低順序為工藝一>工藝二，小鼠背部皮膚病理切片結(jié)果也證實了復(fù)方土茯苓方改善皮膚炎癥的作用，綜上，確立冰苓止癢噴霧的最佳提取工藝路線為全方醇提，可見此工藝路線能最大程度發(fā)揮該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

美國運籌學(xué)家Saaty[27]于1977年提出層次分析法作為一種新的系統(tǒng)分析方法，將定性與定量分析相結(jié)合，具有易操作性、實用性和系統(tǒng)性等優(yōu)點。相比于模糊層次分析法而言，層次分析法構(gòu)建層次結(jié)構(gòu)的過程較復(fù)雜，計算繁瑣；在權(quán)重的確定上，會受到評價人主觀因素的影響[28]。本實驗采用模糊層次分析法，將評價系統(tǒng)分為目標(biāo)層、準(zhǔn)則層、方案層，構(gòu)造模糊互補(bǔ)判斷矩陣和模糊一致矩陣，得到權(quán)重值并求出各方案的優(yōu)劣次序。這樣既考慮了主觀上的影響，又考慮到了各項指標(biāo)之間的相互聯(lián)系和影響，具有一定的科學(xué)性，為來源于臨床經(jīng)驗方的中藥復(fù)方制劑的提取工藝研究提供新思路與新方法。