李 剛，吳清韓，劉志聰，吳銳冰

（1.韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041；2.廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 潮州 521041）

茶樹(shù)是山茶科山茶屬灌木或喬木.蒴果圓球形，直徑2.5-3厘米，2-3室，每室有種子1-2 個(gè)，果皮厚木質(zhì)（圖1A），果實(shí)成熟后裂開(kāi)，種子（茶籽）脫落（圖1B），種子外層木質(zhì)狀殼為種皮）（圖1C）［1］.我國(guó)茶樹(shù)栽培歷史悠久，分布廣泛，種質(zhì)資源豐富［2］.鳳凰單叢茶是廣東省潮州市鳳凰鎮(zhèn)茶農(nóng)經(jīng)鳳凰水仙選育而來(lái)的優(yōu)異單株，以其單株（叢）采收、單株（叢）加工而得名［3］，文中簡(jiǎn)稱鳳凰茶.近年來(lái)，鳳凰茶的經(jīng)濟(jì)效益帶動(dòng)了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展，提高了人民的生活水平.但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前鳳凰茶茶農(nóng)、茶葉生產(chǎn)企業(yè)對(duì)茶樹(shù)的種植、茶葉加工、茶葉產(chǎn)品創(chuàng)新開(kāi)發(fā)等方面關(guān)注較多，而茶樹(shù)果實(shí)所具有的潛在經(jīng)濟(jì)效益卻未得到關(guān)注及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用.加之鳳凰單叢茶主要沿習(xí)單株種植、單株采摘、單株制茶的傳統(tǒng)制茶工藝，且鳳凰茶樹(shù)主要以異花傳粉，茶農(nóng)為了保證茶葉品質(zhì)如初，鳳凰茶樹(shù)的繁殖方式主要以扦插代替有性繁殖，進(jìn)一步導(dǎo)致茶果需求更為減少，茶樹(shù)果實(shí)除極少數(shù)用于繁殖以外，其余大部分自然脫落，造成資源浪費(fèi).

圖1 茶樹(shù)果實(shí)及種子

目前關(guān)于茶樹(shù)果實(shí)的利用偏向于油茶種子的綜合利用［4］；樊興土等研究了茶果的主要化學(xué)成分及其在成熟過(guò)程中的變化規(guī)律［5］；張衛(wèi)明等研究了茶果粗脂肪與粗皂甙的積累，報(bào)道了茶果在成熟過(guò)程中粗皂甙及粗脂肪的積累情況［6］；鄭德勇等研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)果實(shí)中含有角鯊烯、甾醇、生育酚等微量的活性物質(zhì)［7］；而關(guān)于鳳凰茶茶果的研究較少.唐裕芳等發(fā)現(xiàn)，鳳凰茶果含有大量多縮戊糖、鞣質(zhì)、黃酮及黃酮苷類等成分，經(jīng)加工后可利用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)［8］.因此鳳凰茶樹(shù)果實(shí)的綜合開(kāi)發(fā)利用具有一定的價(jià)值.

鳳凰茶產(chǎn)業(yè)的順利發(fā)展，離不開(kāi)有機(jī)茶園的建設(shè).但是茶園農(nóng)藥的不合理使用一直是困擾有機(jī)茶園建設(shè)的一個(gè)問(wèn)題.茶作為重要植物資源，茶葉的抑菌作用已經(jīng)廣為人知，因此本研究以茶樹(shù)果皮和種皮為研究對(duì)象，研究其抑菌效果，為茶樹(shù)果皮和種皮的綜合應(yīng)用，為開(kāi)發(fā)新型殺菌劑建設(shè)生態(tài)茶園具有重要意義.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究鳳凰單叢茶果皮與種皮體外抑菌作用，分析其醇提取液對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果，以此來(lái)彌補(bǔ)鳳凰單叢茶的研究空缺，使茶果變廢為寶，為植物源除草劑的開(kāi)發(fā)及茶果的綜合利用及生態(tài)茶園建設(shè)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：鳳凰茶果，采自廣東省潮州市鳳凰山，洗凈后人工剝離果皮與種皮，55 ℃烘干備用.

供試菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由韓山師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基.

試劑：氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學(xué)試劑，以上試劑由韓山師范學(xué)院植物研究所提供.

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高壓蒸汽滅菌鍋，單人單面超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，烘箱，pH 試紙，玻璃棒，漏斗，燒杯，培養(yǎng)皿，濾膜過(guò)濾器等.

1.2 方法

1.2.1 鳳凰茶果皮與種皮醇提取液的制備及其濃度的確定

分別稱取鳳凰茶果皮20.15 g，種皮20.18 g，剪碎后研磨，各加入150 mL 70%乙醇溶液，浸泡過(guò)夜（10 h-12 h），濾過(guò)液4 ℃冰箱保存，濾渣分別用150 mL 蒸餾水浸泡過(guò)夜（10 h-12 h），濾出液與之前相應(yīng)醇提取液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，分別制得鳳凰茶果皮和種皮醇提取液.將提取液置4℃保存待用.濾渣烘干稱重，然后分別計(jì)算醇提取液的濃度［9］.

計(jì)算公式：提取液濃度（g/L）=［原材料質(zhì)量（g）-濾渣質(zhì)量（g）］/濃縮液體積（L）.

1.2.2 培養(yǎng)基制備

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基按照《微生物試驗(yàn)手冊(cè)》制備［10］.

1.2.3 菌懸液的制備

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3 種供試細(xì)菌菌種分別接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，分別挑取3 種供試細(xì)菌單克隆菌落各接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（30 mL）中，置37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h得到相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)液［11］.

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

抑菌圈大小測(cè)定：牛津杯法.吸取100 μL供試細(xì)菌液加于無(wú)菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，涂布棒涂布均勻.取無(wú)菌牛津杯垂直置于培養(yǎng)基上，輕輕按壓，使牛津杯與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，每皿4 個(gè).將鳳凰茶果皮與種皮醇提取液分別用無(wú)菌水按三倍稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度的溶液，醇溶液做為對(duì)照.分別加200 μL 鳳凰茶果皮與種皮提取液于牛津杯中，每個(gè)培養(yǎng)皿中滴加一種濃度的鳳凰茶果皮或種皮醇提取液，每組3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn).平板在室溫下放置20 min 后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，取出測(cè)定抑菌圈直徑大小，計(jì)算三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，抑菌圈平均直徑≤6 mm（牛津杯直徑），則對(duì)應(yīng)濃度已無(wú)抑菌效果，據(jù)此比較各濃度的抑菌效果［12-14］.

最低抑菌濃度（MIC50）測(cè)定：采用平板稀釋法，將鳳凰茶果皮與種皮醇提取液分別用無(wú)菌水按三倍稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度的溶液，加各濃度的提取液0.5 mL于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中，各平板加入待測(cè)菌液0.2 mL，涂布均勻，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，重復(fù)3次.以只加菌懸液為對(duì)照組.根據(jù)平板菌落數(shù)計(jì)算抑菌率.

抑菌率＝（對(duì)照皿菌落數(shù)－試驗(yàn)皿菌落數(shù)）/對(duì)照皿菌落數(shù)×100%，以抑菌率50%提取液濃度計(jì)算MIC50結(jié)果［15-16］.用統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)顯著性差異.

1.3 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS11.5軟件，對(duì)抑菌試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同試驗(yàn)菌及不同濃度提取液之間的差異顯著性均采用LSD法進(jìn)行多重比較.繪圖使用office 2007.

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳凰茶果皮與種皮提取液濃度

取同質(zhì)量的果皮與種皮，經(jīng)醇提、濃縮后，發(fā)現(xiàn)種皮濾渣質(zhì)量明顯高于果皮，表明果皮中有更多的次生物質(zhì)被提取.獲得的果皮與種皮的提取液濃度有明顯差異，果皮提取液的濃度（456.89 g/L）明顯高于種皮提取液（249.10 g/L）（表1）.

表1 鳳凰茶果皮與種皮提取液濃度

2.2 抑菌圈的測(cè)定結(jié)果與分析

采用牛津杯法測(cè)定了鳳凰茶果皮與種皮提取液的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鳳凰茶果皮提取液對(duì)3 種供試細(xì)菌均有抑制作用（最小有效抑菌濃度為5.64 g/L），且抑菌作用隨提取液濃度的增加而顯著增強(qiáng).果皮提取液對(duì)3 種供試細(xì)菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌.當(dāng)果皮醇提取液濃度在456.89 g/L 時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)22.67 mm、18.33 mm、15.00 mm，抑菌效果明顯；當(dāng)提取液濃度為5.64 g/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌仍有抑菌效果.

與果皮提取液相似，鳳凰茶種皮提取液對(duì)3 種供試細(xì)菌也有明顯抑制作用，且抑菌作用隨提取液濃度的增加而顯著增強(qiáng).種皮提取液對(duì)3 種供試細(xì)菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌，與鳳凰茶果皮提取液相同.種皮提取液濃度在249.10 g/L 時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)25.00 mm、24.67 mm、17.33 mm，具有很強(qiáng)的抑菌效果.雖然種皮提取液在高濃度的抑菌作用明顯，但其最小有效抑菌濃度為27.68 g/L，而果皮提取液為5.64 g/L，其抑菌作用弱于果皮提取液（圖2）.

圖2 鳳凰茶種皮提取液（A）和果皮提取液（B）對(duì)供試細(xì)菌的抑菌圈直徑

2.3 最低抑菌濃度（MIC50）的測(cè)定

采用三倍稀釋法測(cè)定了鳳凰茶果皮與種皮提取液對(duì)3種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC50），結(jié)果表明，鳳凰茶果皮和種皮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC50分別為5.64 g/L和9.23 g/L，對(duì)大腸桿菌的MIC50分別為5.64 g/L和9.23 g/L，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC50為16.92 g/L和27.68 g/L.總體分析，鳳凰茶果皮提取液的抑菌作用要強(qiáng)于種皮提取液.兩種提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯抑菌作用，且抑菌效果相似，分別為對(duì)金黃色葡萄球菌最強(qiáng)，大腸桿菌次之，其次為枯草芽孢桿菌（表2）.

表2 鳳凰茶果皮提取液及種皮提取液對(duì)供試細(xì)菌的MIC50

3 討論

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鳳凰茶果皮及種皮對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于枯草芽孢桿菌.本文探討的鳳凰茶果皮及種皮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用為鳳凰單叢茶茶果的抑菌價(jià)值提供了依據(jù)，為鳳凰茶果皮和種皮的綜合利用開(kāi)發(fā)提供了思路.基于這樣的抗菌理念，可以賦予鳳凰茶茶果新的利用價(jià)值，鳳凰茶果在潮汕地區(qū)資源豐富，若能以其為原料進(jìn)行植物源抗菌劑的開(kāi)發(fā)，可廣泛用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，也可以作為植物源殺菌劑用于有機(jī)茶園的管理，將為鳳凰茶的綜合開(kāi)發(fā)利用開(kāi)拓廣闊的前景.

本實(shí)驗(yàn)將鳳凰茶果果皮與種皮分開(kāi)作為材料，旨在探究鳳凰茶果果皮與種皮抑菌作用的區(qū)別及有效成分的差異，鳳凰茶果果皮與種皮均具有明顯的抑菌作用，但二者又有所不同，茶果果皮的抑菌效果要強(qiáng)于種皮，為了深入研究其抑菌效果，后續(xù)工作準(zhǔn)備對(duì)提取液進(jìn)行成分分離，并對(duì)有抑菌活性的物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和鑒定，闡明其抑菌機(jī)制，進(jìn)一步為鳳凰茶的綜合利用提供理論依據(jù).