李家瑞， 徐 彧， 徐海瑾， 李建寧， 李 巖， 宋 輝， 楊 怡

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學內(nèi)分泌學研究所，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學與細胞生物學系，銀川 750004）

大鼠是第一種用于科學研究的哺乳動物，因其生理調(diào)節(jié)能力和藥理反應等方面與人類相似[1]，常作為動物模型廣泛地應用于生理、藥理與毒理研究。但大鼠胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的建立直到2008 年才得以成功[2]。ESCs 能夠分化為機體所有類型細胞[3]，為研究再生醫(yī)學[4-5]和發(fā)育生物學提供了豐富的細胞來源。ESCs 的體外分化通常需要先形成類胚體（embryoid bodies，EBs）[5]，EBs 是三維的細胞聚集體，含有3 個胚層的所有細胞類型[6]。體外形成的EBs通過定向誘導分化的方法，可以獲得個體發(fā)育早期體內(nèi)的一些前體細胞群[7]，如心肌細胞[8-9]、神經(jīng)細胞[10]、血細胞[11]、胰腺細胞[12]等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用小鼠EBs 的誘導方法將大鼠ESCs 誘導分化為EBs 的過程中細胞死亡率極高，獲得EBs 的數(shù)量也無法滿足后續(xù)實驗的需要。因此，有效地生產(chǎn)大鼠EBs，是使用大鼠ESCs 定向分化成所需細胞類型進行相關(guān)科學研究的關(guān)鍵。本研究通過懸滴法和懸浮法[13]將大鼠ESCs 制備為EBs 并連續(xù)培養(yǎng)10 d，在第5 天和第10 天對其進行形態(tài)學觀察、直徑測量、數(shù)量統(tǒng)計以及特異性基因與蛋白表達的檢測，對兩種方法得到的EBs 進行比較，了解兩種方法的優(yōu)劣，篩選在不同情況下更適宜的EBs 制備方法，為通過EBs 途徑體外分化特定類型細胞用于臨床疾病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

熒光定量PCR 儀、酶標儀、電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；核酸超微量儀（德國GE 公司）；化學發(fā)光成像儀（美國Azure 公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；高速冷凍離心機（美國Thermo Pisher Scientific 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 主要試劑

BCA 蛋白檢測試劑盒與全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基公司）；10%PAGE 凝膠快速制備試劑盒與蛋白Maker（中國雅酶公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與RT-qPCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；穩(wěn)定性ECL 發(fā)光液（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；絲裂霉素C（美國Sigma 公司）；DMEM、DMEM/F12、Neurobasal、MEM Non-Essential Amino Acids、N2、B27、L-Glutamine、β-mercaptoethanol、青霉素鏈霉素雙抗生素溶液、胎牛血清（美國Gibco 公司）；引物合成（上海生工公司）；OCT4 與Naong 抗體（美國Affinity 公司）；Nestin 與AFP 抗體（SAB 公司）；Brachyury、GAPDH、山羊抗兔IgG 與山羊抗兔IgG/Cy3 抗體（Bioss 公司）；CHIR99021與PD0325901（美國APExBIO 公司）。

1.3 飼養(yǎng)層的制備

將小鼠原代胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）培養(yǎng)至第3 代，待MEF 長滿瓶底時向培養(yǎng)基中加入絲裂霉素-C（Mitomycin-C），終濃度為10 μg·mL-1，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置2 h。然后將MEF 消化為單細胞懸液，接種于提前用明膠處理1 h 以上的六孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.4 ESCs 的培養(yǎng)

將ESCs 接種在飼養(yǎng)層細胞上，放入37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，每天換液。ESCs 細胞培養(yǎng)基為N2B27 培養(yǎng)基，并添加3 μmol·L-1CHIR99021和1 μmol·L-1PD0325901。N2B27 培養(yǎng)基成分主要由250 mL DMEM/F12 與Neurobasal 培養(yǎng)基，5 mL 非必需氨基酸、N2 與谷氨酰胺，10 mL B27以及3 μL β-mercaptoethanol 組成。

1.5 類胚體的培養(yǎng)

將培養(yǎng)至第3 代的ESCs 用胰酶消化，移入明膠處理過的培養(yǎng)皿中沉降20 min 左右，在光學顯微鏡下觀察MEF 貼壁后，將未貼壁的ESCs移入15 mL 的離心管離心，留下細胞沉淀。懸浮法[13]：用類胚體培養(yǎng)基（N2B27 培養(yǎng)基添加0.75 μmol·L-1CHIR99021 和0.25 μmol·L-1PD 0325901）重懸沉淀的細胞，轉(zhuǎn)入90 mm 低黏附性無菌培養(yǎng)皿中，隔天換一次液；懸滴法[13]：用類胚體培養(yǎng)基重懸沉淀，用移液槍吸取35 μL 細胞懸液，滴加到90 mm 低黏附性無菌培養(yǎng)皿的皿蓋上，每滴間隔約0.5 cm，重復此操作直至皿蓋滴滿，快速將皿蓋翻轉(zhuǎn)過來，蓋到加有PBS 或蒸餾水的90 mm 低黏附性無菌培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)為懸浮培養(yǎng)。

1.6 RT-qPCR 檢測ESCs 與EBs 的特異性基因

運用TIANGEN 總RNA 提取試劑盒提取懸浮法培養(yǎng)第5 天（xf5）、第10 天（xf10）以及懸滴法培養(yǎng)第10 天（xd10）的類胚體和ESCs 的RNA，用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照TaKaRa RT-qPCR 試劑盒說明書進行RT-qPCR實驗，檢測各組樣品的基因表達水平，引物序列見表1。

表1 大鼠ESCs 向EBs 分化過程中相關(guān)基因引物

1.7 Western blot 檢測ESCs 與EBs 的特異性蛋白

采用凱基全蛋白提取試劑盒提取xf5、xf10以及xd10 的類胚體和ESCs 的總蛋白，并使用凱基BCA 蛋白含量檢測試劑盒進行定量。用雅酶10%PAGE 凝膠快速制備試劑盒制備凝膠并電泳，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。以GAPDH（1∶5 000）為內(nèi)參，以兔一抗OCT4（1∶1 000）、Naong（1∶1 000）、Nestin（1∶1 000）、AFP（1∶1 000）以及Brachyury（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。將ECL 發(fā)光液滴加在蛋白條帶上，放入蛋白成像系統(tǒng)中檢測并記錄蛋白條帶。

1.8 免疫熒光檢測EBs 的表面抗原

4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 漂洗3次。0.5% Triton 穿孔10 min，PBS（0.05% triton-100/PBS）漂洗5 次，5%山羊血清封閉30 min，以GAPDH（1∶300）為內(nèi)參，孵育兔一抗OCT4（1 ∶300）、Naong（1∶300）、Nestin（1∶60）、AFP（1∶60）以及Brachyury（1∶300），4 ℃過夜。PBS 漂洗3 次，孵育山羊抗兔二抗IgG/Cy3（1∶400）（避光操作），室溫1 h，PBS 漂洗3 次。5 μg·mL-1Hoechst 33342染色10 min，PBS 漂洗3 次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用成組t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCs 形態(tài)學觀察及多能基因mRNA 和蛋白水平的檢測

在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠ESCs 貼附在飼養(yǎng)層上，克隆狀分布，細胞間界限清晰，呈圓形或橢圓形，邊緣較光滑，輪廓清晰，見圖1A。RT-qPCR 結(jié)果表明，誘導制備的ESCs 和EBs 均能夠表達多能基因Naong 和OCT4，但隨著培養(yǎng)時間的增長，多能基因表達逐漸降低，與ESCs 相比，EBs（xf5、xf10 和xd10）中OCT4 與Naong 基因的表達量均降低（P 均<0.05），見圖1B。Western blot 結(jié)果顯示，ESCs 中多能蛋白Naong 和OCT4的表達量均高于EBs（xf5、xf10 和xd10）（P 均<0.05），見圖1。

圖1 ESCs 形態(tài)學觀察及多能基因OCT4 與Naong mRNA 和蛋白檢測

2.2 EBs 形態(tài)學觀察、數(shù)量統(tǒng)計及直徑檢測

在倒置顯微鏡下觀察，EBs 呈圓形或橢圓形球體，邊緣光滑，細胞間聯(lián)系緊密。隨后對形成的EBs 進行計數(shù)與直徑測量，結(jié)果顯示，懸滴法制備的EBs 生成率低于懸浮法（P 均<0.01），但同質(zhì)性更好，而懸浮法制備的EBs 數(shù)量更多，操作更為簡便，見圖2。

圖2 EB 形態(tài)學觀察、數(shù)量統(tǒng)計及直徑檢測

2.3 RT-qPCR 檢測EBs 特異基因表達水平

懸浮法制備的EBs 成功表達AFP、Gata-6、cdh1、Gata-1、Mixl1、Brachyury、Nestin、VIM 等 三胚層基因，并且隨著EBs 培養(yǎng)天數(shù)的增加，內(nèi)胚層基因AFP 表達升高（P<0.05），Gata-6 和cdh1 的表達無明顯變化（P＞0.05）；中胚層基因Brachyury表達降低（P<0.05），Gata-1 和Mixl1 表達無明顯變化（P＞0.05）；外胚層基因VIM 表達降低（P<0.05），Nestin 表達無明顯變化（P＞0.05），見圖3A。RT-qPCR 結(jié)果顯示，xf10 的EBs 三胚層基因表達均高于xd10 的EBs（P 均<0.05），見圖3B。

圖3 RT-qPCR 檢測EBs 特異基因表達

2.4 Western blot 檢測EBs 特異蛋白與表面抗原表達水平

懸浮培養(yǎng)的EBs 隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，內(nèi)胚層蛋白AFP 表達增強，中胚層蛋白Brachyury 表達下降，外胚層蛋白Nestin 表達略有增加；而同時期xf10 的EBs 三胚層蛋白表達均高于xd10 的EBs。通過細胞免疫熒光檢測EBs 表面抗原發(fā)現(xiàn)，EBs 能夠表達特異蛋白Naong、OCT4、AFP、Nestin與Brachury 等，見圖4。

3 討論

ESCs 具有發(fā)育的全能性，能夠分化為機體所有類型的細胞，盡管存在倫理問題[14]和異體移植的免疫排斥反應[15]，但ESCs 仍是細胞療法最有希望的細胞來源。目前，ESCs 的體外分化方式主要有兩種，第一種為單層黏附培養(yǎng)[16]，即讓ESCs在貼壁的培養(yǎng)環(huán)境下，通過向培養(yǎng)液中添加生長因子及其他種類化學誘導劑，或者將ESCs 與其他種類細胞共培養(yǎng)[17]，使ESCs 向某種特定類型細胞定向誘導分化。第二種是讓ESCs 在高密度的環(huán)境中過度生長，形成三維結(jié)構(gòu)即EBs，以啟動分化，這種分化方式更加穩(wěn)定且分化效率更高。

研究表明，EBs 分化的主要影響因素包括培養(yǎng)基組成[18]、細胞數(shù)量[19]、EBs 大小[20]和EBs 形態(tài)[21]。EBs 大小會直接影響其向下游分化的結(jié)果[22]，可能是EBs 中單個細胞對微環(huán)境的感知和應激造成的。當EBs 超過一定的大小范圍時，這種影響更加明顯，EBs 外圍的細胞傾向于分化為原始內(nèi)胚層細胞[23]，而EBs 中心的細胞則傾向于形成原始的外胚層細胞。不同形態(tài)的EBs 也表現(xiàn)出不同的分化傾向[21]。

本研究對兩種方法制備的EBs 進行了形態(tài)學觀察、數(shù)量統(tǒng)計與直徑檢測，發(fā)現(xiàn)懸滴法培養(yǎng)的EBs 直徑大、同質(zhì)性好，但生成效率低；而懸浮法培養(yǎng)的EBs 直徑小、同質(zhì)性差，但生成效率高，適宜大量制備。隨后對EBs 三胚層特異基因與蛋白的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)懸浮法比懸滴法培養(yǎng)的EBs 三胚層特異基因與蛋白表達更高，這可能是懸浮法培養(yǎng)的EBs 分化不同步，包含多種類型導致的。

除此之外，EBs 的培養(yǎng)時間也可能對后期分化產(chǎn)生影響。目前，大多數(shù)通過EBs 途徑進行體外定向誘導分化的實驗，是將EBs 培養(yǎng)至5～10 d 進行貼壁分化培養(yǎng)[19]。本研究通過懸浮法培養(yǎng)將大鼠ESCs 制備為EBs 并培養(yǎng)至第10 天，對培養(yǎng)第5 天和第10 天的EBs 進行比較，通過RTqPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，EBs 均可表達AFP、Gata-6、cdh1、Gata-1、Mixl1、Brachuny、Nestin 與VIM 等三胚層基因，證明EBs 可以分化為機體所有類型細胞。另外，隨著EBs 培養(yǎng)時間的增長，不同時期的EBs三胚層基因表達發(fā)生了變化。EBs 內(nèi)胚層基因表達增加，而外胚層與中胚層基因表達逐漸減少，說明EBs 三胚層基因表達具有時間性。

綜上所述，懸滴法可以控制EBs 形成時的起始細胞數(shù)，從而得到大小均一、發(fā)育同步的EBs，更為適合體外分化實驗，但一次難以制備大量EBs；懸浮法可以制備大量的EBs，但所獲EBs 差異大，發(fā)育不同步。研究[24]表明EBs 大小與均勻性將影響ESCs 的體外定向誘導分化?？偠灾疚耐ㄟ^兩種方法成功制備了大鼠EBs，并且發(fā)現(xiàn)EBs 培養(yǎng)時間的不同也對EBs 體外分化具有很大的作用，對今后通過EBs 途徑進行體外分化實驗具有一定的研究價值與參考意義。