張志蕊， 陳耀平

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

遲發(fā)性性腺功能減退癥（late-onset hypogonadism，LOH）是一種與老齡相關(guān)的臨床和生化綜合征，其特點是一系列特異的臨床癥狀和血清T水平缺乏（低于年輕的健康成年男性參考范圍）[1，2]。由于睪酮的作用廣泛涉及生殖、皮膚、泌尿肌肉、骨骼、心血管等存在雄激素受體的系統(tǒng)，LOH 的發(fā)生會導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的改變，且使多器官系統(tǒng)的功能受到影響[3]。研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA 可以非常準(zhǔn)確地作為衰老[4]、癌癥[5-7]、肌肉疾病[8-9]和神經(jīng)退行性疾病有前途的生物標(biāo)記物[10]。課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p 在LOH 患者低表達(dá)，并且miR-133a 作為肌肉特異性的miRNA，能促進(jìn)肌肉的成熟，降低肌肉蛋白質(zhì)分解的速度而促進(jìn)肢體骨骼肌的健康[12-13]。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)及干擾慢病毒載體并篩選建立miR-133a-3p 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究miR-133a-3p與LOH 的相關(guān)機(jī)制以及LOH 的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF 級2 月齡SD 雄性大鼠3 只，體質(zhì)量190～220 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；大腸桿菌菌株DH5α，慢病毒載體GV309、GV280及Polybrene 均購自上海吉凱基因科技有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司；Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和TB GreenqRTPCR、DNase I、TB Green Advantage qPCR Premix均購自日本TaKaRa 公司，Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司，限 制 性 內(nèi) 切 酶AgeⅠ、NheⅠ及EcoRⅠ均購自美國NEB 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen 公司，miR-133a-3p 引物合成由廣州銳博生物科技有限公司完成，質(zhì)粒測序由上海吉凱基因科技有限公司完成；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）購自Abcam 公司。

1.2 大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（corpus cavernosum muscle cell，CCSMC）的原代培養(yǎng)及鑒定

采用改良組織塊法原代培養(yǎng)大鼠CCSMCs[14]，選取2 月齡雄性SD 大鼠，頸椎脫臼或異戊巴比妥鈉注射處死大鼠，放入75%乙醇浸泡15 min。在超凈臺無菌條件下剪開包皮，在陰莖腳處截取陰莖，將其迅速移入含雙抗預(yù)冷PBS 中洗去血漬并除去尿道、纖維及脂肪等組織。

將海綿體組織剪成0.5～1.0 mm3的組織塊（組織塊太大影響細(xì)胞爬出，太小會對細(xì)胞有損傷），按0.5 cm 的間隔放置到涂有20%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基的無菌T25 培養(yǎng)瓶底部，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶后加入3～4 mL 20%完全培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱5 h 后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織與培養(yǎng)液充分接觸，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第4 天顯微鏡下觀察可見細(xì)胞從組織塊中爬出，次日去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。以后每隔2～3 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合約90%時，用胰酶消化細(xì)胞，后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將懸液置于培養(yǎng)皿中，靜置20 min 后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，再次靜置、貼壁，反復(fù)2 次后，將培養(yǎng)皿放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，細(xì)胞融合約90%，按1∶3 傳代培養(yǎng)。同時載玻片放置于6 孔板中，傳至P2 代，后按1×105個/孔接種，待細(xì)胞匯合約70%，行免疫熒光鑒定實驗。

1.3 miR-133a-3p 過表達(dá)及干擾慢病毒載體的構(gòu)建

1.3.1 慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)miRBase（http://www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計擴(kuò)增大鼠miR-133a-3p 前體序列的引物及成熟體反向互補(bǔ)序列，引物信息見表1。構(gòu)建miR-133a-3p 過表達(dá)慢病毒載體為GV309，原件順序為hU6-MCSUbiquitin-EGFP-IRES-puromycin；構(gòu)建miR-133a-3p 干擾慢病毒載體為GV280，原件順序為S-UbiquhU6-MCitin-EGFP-IRES-puromycin，均由上海吉凱基因科技有限公司提供。用限制性內(nèi)切酶AgeI 和EcoRI 在37 ℃條件下分別酶切載體GV309、GV280。3 h 后獲得酶切后的線性載體。1）以大鼠基因組DNA 為模板擴(kuò)增miR-133a-3p前體序列，擴(kuò)增體系為（50 μL）：ddH2O 32.5 μL；5×PS Buffer 10 μL；dNTP Mix（4 μL）；上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL；模板（10 ng·μL-1）1 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)后72 ℃延伸8 min。得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳用DNA 純化試劑盒進(jìn)行切膠回收，然后將回收的片段和線性化載體進(jìn)行重組反應(yīng)，實現(xiàn)線性化載體和目的片段的體外環(huán)化。2）根據(jù)設(shè)計的反向互補(bǔ)序列分別合成兩段寡核苷酸序列，見表2，合成后成對的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90 ℃水浴15 min，自然冷卻至室溫，通過T4 DNA ligase 將雙酶切線性化載體和退火雙鏈DNA 連接，16 ℃過夜，得到重組產(chǎn)物。兩種重組產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（escherichia coli）DH5α，涂布LB固體培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取平板上的單克隆進(jìn)行PCR 鑒定，對陽性克隆進(jìn)行測序及結(jié)果分析。將正確克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)、抽提，獲得高純度質(zhì)粒，用于下游病毒包裝。

表1 引物信息

表2 DNA 寡核苷酸序列

1.3.2 慢病毒包裝 采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞的方法進(jìn)行慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染前24 h，消化對數(shù)生長期的293T 細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基重新接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h 待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，更換為無血清培養(yǎng)基，2 h 后向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA 溶液（GV載體質(zhì)粒20 μg、pHelper1.0 載體質(zhì)粒15 μg、pHelper 2.0 載體質(zhì)粒10 μg），相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為1 mL，在室溫下溫育15 min，混合液緩慢滴加至293T 細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基加入10 mL PBS 清洗1 次，加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，收集細(xì)胞上清液，4 ℃、4 000×g 離心10 min，去細(xì)胞碎片，0.45 μm 過濾后，4 ℃、25 000 r·min-1離心2 h，棄上清，加病毒保存液，輕輕反復(fù)吹打重懸，充分溶解后10 000 r·min-1離心5 min 后分裝，-80 ℃保存。

1.3.3 慢病毒滴度測定 測定前一天，將293T細(xì)胞按4×104個/孔鋪96 孔板，準(zhǔn)備7～10 個無菌的EP 管，將病毒原液按10 倍梯度稀釋：每管中加入90 μL 無血清培養(yǎng)基，將待測定的病毒原液10 μL 加入第1 個管中，混勻后，取10 μL 加入第2 個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管；選取所需的細(xì)胞孔，棄去90 μL 培養(yǎng)基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入完全培養(yǎng)基100 μL，48 h 后熒光顯微鏡下觀察熒光亮度并拍照。根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量計算病毒滴度，病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.4 感染復(fù)數(shù)

CCSMCs 細(xì)胞按5×104個/孔接種96 孔板，共21 孔。將miR-133a-3p up 及down 慢病毒稀釋液及A/P 增強(qiáng)液分別加入相應(yīng)的孔中，使其感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）分別為0、1、10 及100，轉(zhuǎn)染12 h 后將病毒液棄掉，添加新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察并拍照。對感染效率進(jìn)行評估，明確CCSMCs 細(xì)胞的感染條件及合適MOI。

1.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

CCSMCs 細(xì)胞按1×105個/孔接種6 孔板，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞匯合約30%時棄掉培養(yǎng)基，加入MOI 為10 的病毒液培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光后，加入含2 μg·mL-1嘌呤霉素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時提取RNA，檢測miR-133a-3p 的表達(dá)。

1.6 qRT-PCR 檢測mir-133a-3p 的表達(dá)

實驗設(shè)為miR-133a-3p 過表達(dá)組、miR-133a-3p 干擾組、陰性對照組和空白對照組，以不感染病毒作為空白對照，感染病毒空載體作為陰性對照。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時，收集6 孔板中的細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，DNase I 處理 去 除RNA 中 的DNA 污 染，然 后 用Nanodrop 2000 測定RNA 的濃度及純度，分別用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit，TB Green Advantage qPCR Premix 按照使用說明書合成miRNA 的第一鏈并進(jìn)行qRT-PCR：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 個循環(huán)。用2-ΔΔCT計算基因相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠CCSMCs 的分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

采用改良組織塊法原代培養(yǎng)CCSMCs，選取2月齡雄性SD 大鼠。原代培養(yǎng)第4 天，顯微鏡下可見少許CCSMCs 從組織塊中爬出，形態(tài)呈梭形（圖1A）。當(dāng)細(xì)胞生長至融合后，細(xì)胞高低起伏，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”樣生長（圖1B），α-SMA 免疫熒光鑒定：熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布在胞核和胞漿中，陽性率達(dá)90%（圖2）。

圖1 顯微鏡下原代培養(yǎng)的CCSMCs

圖2 CCSMCs 免疫熒光鑒定（×200）

2.2 miR-133a-3p 慢病毒載體的構(gòu)建及測序結(jié)果

miR-133a-3p 過表達(dá)及干擾慢病毒載體GV309 和GV280（圖3A、B）。將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于適量含相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液進(jìn)行測序，并與miR-133a-3p 的反向互補(bǔ)序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明，測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致（圖3C、D）。

圖3 GV309 和GV280 載體結(jié)構(gòu)及測序

2.3 慢病毒滴度測定

構(gòu)建完成的miR-133a-3p 過表達(dá)慢病毒滴度為3×108TU·mL-1，miR-133a-3p 干擾慢病毒滴度為1×109TU·mL-1（圖4）。

圖4 慢病毒熒光法滴度測定（×100）

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

miR-133a-3p 過表達(dá)及干擾慢病毒載體感染CCSMCs 細(xì)胞72 h 后，Polybrene 濃度為2 μg·mL-1時，轉(zhuǎn)染效率最高，且效率>80%，篩選后得到目的細(xì)胞（圖5、圖6）。

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染72 h 后的CCSMCs（×100）

圖6 嘌呤霉素篩選10 d 的CCSMCs（×100）

2.5 miR-133a-3p 相對表達(dá)量的測定

qRT-PCR 檢測各組穩(wěn)轉(zhuǎn)株中miR-133a-3p的表達(dá)情況。如圖7 所示，與陰性對照組相比，過表達(dá)組的miR-133a-3p 表達(dá)量升高，干擾組miR-133a-3p 的表達(dá)量降低（P 均<0.01），說明本研究成功構(gòu)建了過表達(dá)及干擾miR-133a-3p 的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

圖7 實時熒光定量分析過表達(dá)組和干擾組穩(wěn)轉(zhuǎn)后miR-133a-3p 的表達(dá)水平

3 討論

LOH 的特征是隨著年齡的增長，肌肉的容積、大小和力量下降，給予雄激素治療，肌肉容積和力量會顯著增加[2，15-16]。本研究采用改良組織塊法培養(yǎng)原代大鼠CCSMCs，在組織塊法原代培養(yǎng)第4 天，平滑肌細(xì)胞從組織塊中爬出，第5 天開始會有成纖維細(xì)胞爬出，采用反復(fù)差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞的污染獲得高純度的CCSMCs。本實驗α-SMA 陽性細(xì)胞率達(dá)90%及以上，從而保證了后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性與可靠性。

miR-133a-3p 是成熟的miRNA，它來源于兩個前體miRNA（miR-133a-1 和miR-133a-2），成熟序列為22nt。miR-133a 具有肌肉特異性表達(dá)的特點，它通過肌肉生長的協(xié)同轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接調(diào)控因子、生長激素通路來調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化過程。Chen 等[17]表明miR-133 可以通過靶向SRF 來增強(qiáng)小鼠成肌細(xì)胞的增殖；Huang 等[18]證實miR-133 在成肌細(xì)胞分化過程中上調(diào)，表明miR-133a-3p 也可作為miR-133家族的一員參與骨骼肌的生肌分化。同時miR-133a 已被證明可調(diào)節(jié)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS 活性[19]，并參與炎癥性心肌病[20]和內(nèi)皮功能障礙[21]。Jiang 等[22]研究結(jié)果表明，miR-133a-3p在維持內(nèi)皮健康的穩(wěn)態(tài)和生理功能中有著重要作用。

源自人類免疫缺陷病毒的慢病毒載體是修飾真核細(xì)胞（如造血干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞）基因的有力工具。慢病毒載體可以將外源基因或外源shRNA 有效地整合到宿主染色體上，從而實現(xiàn)目的序列持久性表達(dá)。慢病毒的宿主相對廣泛，無論對分裂或非分裂細(xì)胞均有感染能力。特別對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如干細(xì)胞、原代細(xì)胞、不分化細(xì)胞等，慢病毒也表現(xiàn)出較好的感染效果。本研究構(gòu)建了miR-133a-3p 過表達(dá)慢病毒載體GV309 和miR-133a-3p 干擾慢病毒載體GV280，并對所構(gòu)建的載體進(jìn)行滴度測定。將構(gòu)建成功的慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠CCSMCs，經(jīng)嘌呤霉素的篩選，對轉(zhuǎn)染后的CCSMCs 進(jìn)行qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示過表達(dá)組miR-133a-3p 的相對表達(dá)量升高，干擾組miR-133a-3p 的相對表達(dá)量降低，說明成功建立了穩(wěn)定表達(dá)miR-133a-3p 的細(xì)胞株，可為后續(xù)開展大鼠miR-133a-3p 的功能研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。