朱文葉 陳新元 李敏

摘要：目的：研究維生素D受體多態(tài)性與原發(fā)性癲癇的相關(guān)性。方法：通過病例對(duì)照研究，納入71例原發(fā)性癲癇患者作為病例組，同期97例健康者作為對(duì)照組，抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血提取DNA，采用PCR-LDR法檢測(cè)維生素D受體單核苷酸位點(diǎn)Cdx-2、 FokI、BsmI及ApaI的多態(tài)性。結(jié)果：病例組和對(duì)照組Cdx-2、FokI、BsmI、ApaI的基因型、等位基因、顯性模型及隱性模型均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：維生素D受體單核苷酸位點(diǎn)Cdx-2、FokI、BsmI及ApaI可能與原發(fā)性癲癇的發(fā)生不相關(guān)。

關(guān)鍵詞：維生素D受體;基因多態(tài)性;原發(fā)性癲癇

ABSTRACT： OBJECTIVE To investigate the association between vitamin D receptor gene polymorphism and primary epilepsy. METHEDS A case-control study was conducted in 71 patients with primary epilepsy and 97 healthy controls. DNA was extracted from peripheral venous blood of all subjects. Polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2、FokI、BsmI and ApaIwere detected by PCR-LDR direct sequencing. RESULTS There was no significant difference in all genotype frequency 、allele frequency 、dominant model and recessive model between case group and control group （P >0.05）. CONCLUSION The polymorphisms of vitamin D receptor gene Cdx-2 （rs11568820）、 FokI （rs2228570）、BsmI （rs1544410） and ApaI （rs7975232） may not be associated with primary epilepsy.

KEY WORDS： vitmin D receptor; gene polymorphism; primary epilepsy

癲癇是最常見及最具潛在危險(xiǎn)性的、多種病因參與的一種慢性中樞系統(tǒng)疾病。目前關(guān)于癲癇確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，一般認(rèn)為是由多種大腦病理性改變的共同終點(diǎn)，如機(jī)械性創(chuàng)傷、出生缺氧、產(chǎn)傷、感染、中風(fēng)、腫瘤。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，遺傳因素作為內(nèi)因在癲癇的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的作用[1-2]。進(jìn)來年發(fā)現(xiàn)越來越多的基因通過多種機(jī)制參與機(jī)體功能和發(fā)育過程，對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。不同個(gè)體應(yīng)用抗癲癇藥物治療的反應(yīng)性有很大的差異，這些差異性可能源于影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)的基因、影響藥物藥效學(xué)的基因和導(dǎo)致癲癇發(fā)作的基因突變[3-7]。

維生素D（vitamin D， VD）屬于脂溶性維生素，是一種維持人體生命所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除調(diào)節(jié)鈣磷代謝、促進(jìn)骨骼發(fā)育、調(diào)節(jié)生物細(xì)胞分化和免疫功能外，VD在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著獨(dú)特作用。VD缺乏會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病以及癲癇等[8-11]。維生素D受體（vitamin D receptor， VDR）是核受體超家族成員之一，主要位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中[12-13]。VDR與VD結(jié)合后通過信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用。研究表明糾正VD缺乏狀態(tài)可以控制癲癇發(fā)作，此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明 [11]增加小鼠海馬區(qū)VD3 水平可以提高誘發(fā)癲癇的閾值;相反，敲除VDR會(huì)增加癲癇的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?；谝陨涎芯浚覀兺茰y(cè)VDR基因的多態(tài)性可能參與了癲癇的發(fā)生。因此，本研究將進(jìn)行VDR SNPs Cdx-2 （rs11568820， G>A）， FokI （rs2228570， T>C）， BsmI （rs1544410， G>A）， ApaI （rs7975232， C>A）的多態(tài)性分析，探討VDR基因多態(tài)性是否與原發(fā)性癲癇發(fā)生相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年3月至7月來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的原發(fā)性癲癇患者共71例，其中男性26例（36.6%），女性45例（63.3%），年齡中位數(shù)為29（23，44），診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2017年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟制訂的癲癇發(fā)作及癲癇分類診斷指南》[14]。同期收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康受試者97例作為對(duì)照組，其中男性35例（36.0%），女性62例（63.9%），年齡中位數(shù)為37（30，47）。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取以及純度和濃度測(cè)定 采集研究對(duì)象外周靜脈血2 ml，按照TIANamp Blood DNA Kit， DP348的說明書提取全血DNA，使用核酸蛋白分析儀對(duì)提取出的DNA 樣本進(jìn)行純度和濃度鑒定， OD260值和OD280值在1.6～1.8之間為合格。

1.2.2 PCR反應(yīng)和SNP檢測(cè) 引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司采用Primer3.0設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增：15 μL 體系：DNA 1 μL，10*bμffer1.5 μL，25 mmol/L 的 MgCl21.5 μL，10 mmol/L 的 DNTP 0.3 μL，10 μmol/L 上下游引物 0.15 μL，5 μmol/μL 的Tap 酶 0.3 μL，加 H2O 補(bǔ)足至15 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30s，55℃退火30 s;72℃延伸90 s;共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸3min。 連接反應(yīng)：10 μL體系：取 3μL PCR產(chǎn)物，10* Taq DNA ligase buffer 0.15 μL，Taq DNA ligase（40U/ul）0.125 μL，探針（10p） 0.01 μL，加 H2O 補(bǔ)足至10 μL。連接條件：94°C 30s，56°C 3min;共30個(gè)循環(huán)。然后取取1μL延伸產(chǎn)物，加8ul上樣，95℃變性3min，立即冰水浴，上測(cè)序儀。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用IBM SPSS （version 25.0; Armonk， NY， USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量采用卡方檢驗(yàn)?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)。采用Logisitc回歸模型校正年齡、性別等變量，所有統(tǒng)計(jì)分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P <0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 經(jīng)χ2在檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組的性別構(gòu)成無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.943），兩組性別構(gòu)成均衡。

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn) 病例組和對(duì)照組VDR 4個(gè)SNPs 的基因型其觀察值與期望值之間分布近似（P >0.05），表明兩組樣本來自遺傳平衡群體，具有群體代表性。

2.3 VDR基因多態(tài)性與原發(fā)性癲癇的易感性分析

所有樣本進(jìn)行VDR基因測(cè)序，BsmI未檢測(cè)到AA基因型，經(jīng)χ2檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組VDR 四個(gè)SNPs基因型頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）（見表1）;進(jìn)一步采用多因素二元Logistic回歸，對(duì)受試者的年齡、性別進(jìn)行校正，分析各位點(diǎn)等位基因模型、顯性模型和隱性模型與成人原發(fā)性癲癇的關(guān)系。結(jié)果顯示： Cdx-2 、FokI、BsmI及ApaI在病例組和對(duì)照組中其不同模型的分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

3 討論

VD在神經(jīng)系統(tǒng)中有調(diào)控腦發(fā)育、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)、神經(jīng)遞質(zhì)合成和神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)等重要作用，是人體必需的神經(jīng)類固醇，參與大腦復(fù)雜的功能活動(dòng)[7]。VD缺乏與癲癇具有相關(guān)性。人體內(nèi)VD水平降低會(huì)增加癲癇發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn);而癲癇人群中，內(nèi)在或外在因素會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)VD水平下降[15]。本研究選取了其中4個(gè)SNPs進(jìn)行研究。

FokI位于VDR基因的5’末端，其多態(tài)性與神經(jīng)保護(hù)相關(guān)，發(fā)生突變會(huì)增加帕金森病、阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。Jiang[19]等發(fā)現(xiàn) FokI AC基因型、ApaI AA基因型在顳葉癲癇組和對(duì)照組中的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cdx-2位于VDR基因的5’啟動(dòng)子區(qū)域，其多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素分泌受損相關(guān)[20]。戴[21]等發(fā)現(xiàn)Cdx-2的基因型在癲癇組和對(duì)照組的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而等位基因的分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AG/（AA+GG）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Cdx-2的多態(tài)性可能與癲癇的發(fā)生相關(guān)。BsmI位于VDR基因的3’端第8內(nèi)含子，其多態(tài)性研究主要集中在骨質(zhì)疏松、糖尿病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明VDR基因3’端BsmI、ApaI 均與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[22-23] 。

在本研究中所選取的VDR 4個(gè)SNPs在原發(fā)性癲癇和對(duì)照組中無論是基因型，還是各種基因模型中其分布均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中BsmI （rs1544410）突變純合子 AA基因型在所有研究對(duì)象中均未檢出，這與戴[21]等的研究結(jié)果一致，同樣Jiang[19]等的研究中AA基因型的頻率也極低，很可能是樣本量太小導(dǎo)致的。VDR基因多態(tài)性可受種族、地域等因素影響，本研究所有樣本來自云南地區(qū)的人群，因樣本量較少且遺傳背景不同，病例組和對(duì)照組統(tǒng)計(jì)可能存在偏倚，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，控制混雜因素如日照、VD攝入、種族、地域等，對(duì)原發(fā)性癲癇發(fā)病機(jī)制做進(jìn)一步研究，若可以進(jìn)行不同地區(qū)多中心研究。

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[基金項(xiàng)目] 云南省教育廳科學(xué)研究基金教師類項(xiàng)目（編號(hào)：2018JS197）

[作者簡(jiǎn)介]朱文葉，主管藥師，研究方向：臨床藥理學(xué)，郵箱：ZWYkyfyy@163.com

[通訊作者]李敏，男，醫(yī)師，研究方向：哮喘與基因組學(xué)，郵箱：869116714@qq.com