劉玲紅 胡明 劉玉慶

摘 要：為了解和掌握山東省動物源大腸桿菌的多重抗藥現(xiàn)象，并分析多重高抗菌株中抗藥基因和毒力基因的分布和共存情況，從山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)（Veterinary antibiotic monitoring resistance system，Varms）菌種庫中選取動物源大腸桿菌，用瓊脂稀釋法進行10種抗菌藥物的藥敏試驗，對5重以上的多重抗藥性菌株進行抗藥譜分析，并選擇多重高抗菌株進行MLST分型，采用PCR方法對常見的21種抗藥基因和15種毒力基因進行分析。結(jié)果顯示，5重以上抗藥菌株占20%左右，9～10重抗藥且最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）遠遠高于R值的多重高抗菌株32株中，均檢測到含有7～13個抗藥基因和0～6個毒力基因共存，其中高檢出率的β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氯霉素類的抗藥基因均為質(zhì)粒介導;毒力基因以fimC、sitA、iucD和hlyF為主要毒力因子，檢出率為40%～90%。兼具抗藥性和毒力的菌株造成嚴重的公共衛(wèi)生威脅和巨大的食品安全潛在危害。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;多重抗藥性;抗藥基因;毒力基因

中圖分類號：S852.61+2 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2022）06-0004-12

隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化發(fā)展，養(yǎng)殖動物處于高營養(yǎng)、高密度的飼養(yǎng)環(huán)境中，自身免疫力低下，各種應激反應和疫苗保護不完全，極易發(fā)生感染[1]。大腸桿菌（Escherichia coli）作為常在菌群容易成為條件致病菌，是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中最常見和最難防治的重要疾病之一[2]。 獸醫(yī)臨床上使用抗菌藥物是防治大腸桿菌病的首要方法，但不規(guī)范使用導致大腸桿菌產(chǎn)生抗藥性，造成抗藥率不斷上升，抗藥譜迅速增寬，藥物壓力下加速了抗藥性基因元件在不同物種間的傳播，不僅形成多重抗藥性，而且抗藥程度也在逐漸加深[3]。同時，大腸桿菌的致病力往往與其所攜帶的毒力基因密切相關(guān)，對感染的發(fā)生和發(fā)展起著決定作用[4]。因此，了解動物源大腸桿菌的抗藥表型、所攜帶抗藥基因和毒力基因以及分布，對把握其動態(tài)發(fā)展有重要的實際意義。

山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)（Verterinary antibiotic resistance system，Varms）是由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所聯(lián)合山東省規(guī)模化養(yǎng)殖集團以及獸藥生產(chǎn)企業(yè)共同創(chuàng)建的獸醫(yī)抗藥性實體監(jiān)測網(wǎng)（http：//www.varms.cn/#/），運用智能化藥敏檢測儀、快速藥敏檢測盒，監(jiān)測養(yǎng)殖場臨床病料、糞樣和環(huán)境樣本的細菌抗藥性，線上通過Varms實時將檢測結(jié)果上傳到Varms數(shù)據(jù)庫，自動匯總，便于集團公司和行業(yè)公共查詢，直接指導臨床用藥。本研究以Varms近年收集動物源大腸桿菌菌株為研究對象，通過分析藥敏數(shù)據(jù)選擇多重高抗菌株，對抗藥基因和毒力基因進行檢測和相關(guān)性分析，關(guān)注多重高抗大腸桿菌潛在的傳播和危害，為山東地區(qū)大腸桿菌病的防控提供了理論參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株ATCC 25922由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生實驗室保存;近年收集動物源大腸桿菌563株，由Varms菌種庫收集與保藏，包括禽源（雞和鴨）和豬源。

試劑與藥品：MHA瓊脂和MH肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司;分析純抗菌藥物慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，購自北京普博欣生物科技有限責任公司; PCR buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶和DNA Marker等，購于天根生化科技（ 北京） 有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）制定的標準藥敏測定方法[5]，采用山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究公共衛(wèi)生研究室自主研發(fā)的智能化藥敏檢測儀[6，7]，對動物源大腸桿菌進行10種藥物的敏感性測定，根據(jù)MIC值和CLSI標準的S（敏感）、I（中介）、R（抗性）值，計算抗藥率，分析抗藥譜型和MIC頻率分布。

1.2.2 大腸桿菌多位點序列分型（MLST） 根據(jù)PubMLST（http：//pubmlst.org）和NCBI上公布的基因片段設計大腸桿菌七個管家基因adK、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA的引物序列，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，大腸桿菌7個管家基因引物序列見表1。

采用水煮法提取大腸桿菌總DNA，MLST的PCR反應體系為50 μL：1×Taq mix 25 μL，上游（F）

和下游引物（R）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，54～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收后由青島華大基因科技有限公司進行測序。用DNA Star軟件根據(jù)Pub MLST的要求對測序結(jié)果進行修正，使7個管家基因均符合國際上關(guān)于大腸桿菌多位點序列分型的序列要求，與Pub MLST數(shù)據(jù)庫中序列進行比對分析，分別獲取7個管家基因位點的等位基因數(shù)值，形成相應的等位基因譜判斷其序列型。

1.2.3 抗藥基因和毒力基因的檢測 檢測大腸桿菌的抗藥基因包括：β-內(nèi)酰胺類：blaCTX-M，blaSHV，blaTEM;喹諾酮類：qnrA，qnrB，qnrS，qepA，oqxA，oqxB;氨基糖苷類：aadA1，aadA2，strA-strB，aadB，aacC2，aac（3'）-IV，aph（3'）-Ia，aph（3'）-IIa;四環(huán)素類：tetA，tetB，tetC;氯霉素類：floR。根據(jù)GenBank和參考文獻[8-12]設計合成大腸桿菌抗藥基因的序列，如表2所示。

PCR反應體系為20 μL：1×Taq mix 10 μL，上游（F）和下游引物（R）各1 μL，模板DNA 2 μL，

ddH2O 6 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min，

95 ℃變性45 s，52～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，

30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

檢測大腸桿菌毒力基因包括：腸毒素astA，大腸桿菌素免疫蛋白基因cva/cvi，非菌毛黏附素eaeA，I型菌毛亞基fimC，耶爾森菌強毒力島核心區(qū)的fyuA，溶血素hlyF，血清抗性蛋白iss，鐵離子攝取相關(guān)基因irp2，氣桿菌素家族的iucD，P菌毛編碼基因papC，鐵結(jié)合蛋白基因sitA，產(chǎn)志賀毒素stx1和stx2，溫度敏感血凝素tsh，轉(zhuǎn)運絲氨酸蛋白酶毒素vat。根據(jù)GenBank 和參考文獻[13-18]設計合成大腸桿菌毒力基因的序列見表3。

PCR反應體系為20 μL：1×Taq mix 10 μL，上游（F）和下游引物（R）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，54～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的藥敏試驗和多重抗藥分析

通過山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)Varms采集各種動物來源的大腸桿菌，根據(jù)CLSI標準藥敏測定方法，采用山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究公共衛(wèi)生研究室自主研發(fā)的智能化藥敏檢測儀，測定MIC值，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，5重以上的多重抗藥性菌株106株，占20%左右，其中養(yǎng)殖環(huán)節(jié)多重抗藥菌株的比例（86%，91/106）高于其他環(huán)節(jié)，如糞便和病料來源的大腸桿菌抗藥程度遠遠高于雞胚和鴨胚來源的大腸桿菌。此部分多重抗藥菌株的抗藥率如圖1所示，對氟苯尼考和氨芐西林的抗藥率達95%以上，恩諾沙星、多西環(huán)素、頭孢噻呋、頭孢噻肟和頭孢曲松抗藥率達80%左右，其余藥物抗藥率在70%左右。

多重抗藥性大腸桿菌為5～10重抗藥，抗藥種類和譜型見表4，其中10重抗藥所占的比例最大，達到37.27%。在10種藥物中，青霉素類的氨芐西林、氨基糖苷類的慶大霉素、四環(huán)素類的多西環(huán)素、氯霉素類的氟苯尼考、頭孢菌素類的頭孢噻呋和喹諾酮類的恩諾沙星，為動物臨床常用藥物;頭孢噻肟和頭孢曲松、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星為人醫(yī)用抗菌藥物，動物臨床禁止使用;但從抗藥率的結(jié)果看，大腸桿菌對同類藥物都具有很高的抗藥性，抗CEF/CRO/CTX的菌株占72.6%，抗LVX/CIP/ENR的菌株占64.2%，說明可能存在交叉抗藥性。

2.2 多重高抗大腸桿菌的MIC分布

從上述多重抗藥性大腸桿菌中選擇9～10重抗藥大腸桿菌32株，對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢噻呋、多西環(huán)素、氟苯尼考的抗藥率為100%;對恩諾沙星、頭孢曲松和慶大霉素，分別各有1株菌為敏感，抗藥率高達96.7%。不但如此，菌株對各種藥物的MIC很高，遠遠高于CLSI規(guī)定的R值，如氨芐西林和氟苯尼考，幾乎所有菌株的MIC都大于等于512 μg/mL;對頭孢類藥物MIC大于等于512 μg/ml的菌株占80%以上;對恩諾沙星和慶大霉素，MIC高于128 μg/ml的菌株占50%以上。這些數(shù)據(jù)表明這些菌株為多重高抗菌株。具體MIC頻率分布見表5。

2.3 多重高抗大腸桿菌的MLST分析

根據(jù)大腸桿菌7個管家基因測序結(jié)果形成相應的等位基因譜后判斷其序列型，如表6所示，多重高抗大腸桿菌ST型高度分散，32株菌共計20種不同型別，其中6株為新型。

2.4 多重高抗大腸桿菌的抗藥基因和毒力基因

抗藥基因：每株動物源多重高抗大腸桿菌中均檢測到含有7～13個抗藥基因（表7）。β-內(nèi)酰胺類blaCTX-M（100%）和blaTEM（90.6%）的檢出率很高，而blaSHV檢出率低于10%，說明前兩個基因為主要流行抗藥基因，與β-內(nèi)酰胺類（青霉素類和頭孢類）的高抗藥表型一致;喹諾酮類oqxB和oqxA的檢出率分別為96.9%和81.3%，是主要抗藥基因，但qnrA、qnrB和qepA未檢到，其中編號為32的菌株未檢測到任何喹諾酮類抗藥基因，其抗藥表型也為敏感，二者具有一致性。氨基糖苷類共檢測8個抗藥基因，均有一定檢出率，分布在34.4%～81.3%之間，組合檢出率為100%，但依然有1株大腸桿菌的抗藥表型是敏感的，說明基因型和表型之間存在一定程度的不一致性;四環(huán)素類抗藥基因tetA和tetC未檢測到，tetB的檢出率為31.1%，與多西環(huán)素100%率不一致，抗藥基因型和抗藥表型并不吻合，表明還存在其它抗藥性機制;氯霉素類floR（81.3%）流行率高達80%以上，與高抗藥性表型一致。

毒力基因：除耶爾森菌強毒力島核心片段fyuA、產(chǎn)志賀毒素stx1、腸毒素astA、溫度敏感血凝素tsh和鐵離子攝取相關(guān)基因irp2未檢出外，共檢測到10種毒力基因，見表8。I型菌毛亞基毒力基因fimC檢出率最高，為90.6%;其次為鐵結(jié)合蛋白sitA、氣桿菌素家族的iucD和溶血素hlyF，分別為78.1%、59.4%和43.8%;血清抗性蛋白iss為21.9%，大腸桿菌素免疫蛋白cva/cvi為12.5%，非菌毛黏附素eaeA、產(chǎn)志賀毒素stx2、轉(zhuǎn)運絲氨酸蛋白酶毒素vat和P菌毛編碼基因papC均為6.3%。

抗藥基因與毒力基因共存：多個抗藥基因和多個毒力基因共存于同一株菌中是普遍現(xiàn)象，見表7和表9，32株多重高抗表型的大腸桿菌中同時含有8個以上抗藥基因和3個以上毒力基因的菌株占87.5%，超過25%的菌株同時含有8～13個抗藥基因和5～6個毒力基因，僅3株未檢測的毒力基因。

3 討論與結(jié)論

3.1 動物源大腸桿菌的抗藥性

抗菌藥物是控制細菌病感染的主要手段，隨著在臨床治療中長期大量使用導致細菌抗藥性的產(chǎn)生，從21世紀初期開始，動物源大腸桿菌出現(xiàn)多重抗藥[19]。研究顯示，大腸桿菌對第一線抗菌藥物如頭孢菌素、喹諾酮類等的抗性增強，并且由于同類抗菌藥物存在相似的母體結(jié)構(gòu)，顯示出與醫(yī)用抗菌藥物的交叉抗藥。質(zhì)粒介導傳播的新一代內(nèi)酰胺酶是大腸桿菌對內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗藥性的重要原因[20]，不同動物源大腸桿菌中也存在質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥因子（plasmid-mediated-quinoloneresistance，PMQR）的細菌抗藥[21]，氟苯尼考抗藥基因floR也為質(zhì)粒介導[22]。本研究的多重高抗大腸桿菌三類檢出率最高的抗藥基因中，blaCTX-M和blaTEM基因的檢出率為100%和90.6%，為大腸桿菌兩類主要的ESBLs基因型;喹諾酮類耐藥因子PMQR以oqxA、oqxB基因為主，均為80%以上;氟苯尼考抗藥基因floR檢出率超過80%。大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類及氟苯尼考抗藥基因floR共存的現(xiàn)象，均為質(zhì)粒介導，勢必加重耐藥水平傳播和引發(fā)多重耐藥的風險[23]。

更加需要引起高度重視的是，本研究中某些大腸桿菌的MIC非常高，甚至高至512 μg/mL，遠遠高于CLSI規(guī)定的抗性值R，并且同時對多種藥物都具有高抗藥性，這樣的菌株在臨床并不罕見。此外，多重高抗大腸桿菌的MLST分型高度分散，新譜型較多，并且不同種動物源之間并無明顯的種屬特異性，菌株可能在不同物種間傳播，增加了包括人在內(nèi)的不同物種共患的可能性。山東獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)Varms長期關(guān)注動物源細菌抗藥性現(xiàn)狀及動態(tài)變化，提供預警機制，采用高通量藥物敏感性試驗篩選較為敏感的抗菌藥物進行治療，盡量避免人畜抗藥率高的抗菌藥物，同時應嚴格控制抗菌藥物用量和使用頻率以避免抗藥性的產(chǎn)生和廣泛傳播。

3.2 多重高抗大腸桿菌毒力基因的公共衛(wèi)生意義

本研究的分離菌株大多為腸道共生菌群，與采樣動物的健康狀況有一定關(guān)系。然而，分離菌株攜帶大量的抗藥基因和毒力基因的檢測結(jié)果提示，動物可能作為抗藥基因和毒力基因的儲存庫，兼具抗藥性和毒力的菌株造成嚴重的公共衛(wèi)生威脅和巨大的食品安全潛在危害。

大腸桿菌的致病性與其毒力因子有關(guān)，編碼毒力因子的基因在動物源和人源致病性大腸桿菌有較高的檢出率和同源性[24]，推測某些人源致病性大腸桿菌和動物源致病性大腸桿菌有潛在的人畜共患風險，且動物是人源致病性大腸桿菌的儲存器[25]。因此，從分子研究水平調(diào)查研究動物源大腸桿菌中抗藥基因和毒力基因的攜帶、共存并探究抗藥性和致病性之間的相關(guān)性，對公共衛(wèi)生安全有重要的意義。

本研究中32株多重高抗大腸桿菌中，I型菌毛毒力基因fimC的檢出率超高90%，大腸桿菌I型菌毛毒力因子廣泛存在于大腸桿菌與絕大多數(shù)腸桿菌表面，能夠介導細菌和宿主細胞之間的相互作用，是細菌感染性疾病成功建立的第一步。I型菌毛單獨存在并不會導致很強的致病力，但這些菌株中較強的毒力因子如氣桿菌素家族的iucD和溶血素hlyF也有較高的流行率，甚至如血清抗性蛋白基因iss和產(chǎn)志賀毒素基因stx2強毒力基因也有檢出，志賀樣毒素（Stx）是一種志賀毒素，具有細胞毒性、腸毒性、神經(jīng)毒性作用，是毒性最強的細菌毒素之一，包括Stx1和Stx2兩種亞型，Stx2較Stx1的毒力更強[26]。這樣的強毒力基因與高抗藥基因共存于菌株中，對動物養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生將是巨大的潛在威脅。對動物源大腸桿菌抗藥基因和毒力因子傳播的控制，抗藥和致病機制的解析和抗菌藥物替代品的研制是今后防控動物源多重高抗高治病大腸桿菌感染的研究方向。

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Analysis of antibiotic resistance genes and virulence genes of multiple high resistant Escherichia coli from animals in Shandong Province*

LIU Linghong1，2， HU Ming1，2**， LIU Yuqing1，2**

（1. Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding， Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan ?250101，China;

2.Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of MARA， P.R.China， Ji’nan ?250101，China）

Abstract： The multiple antibiotic resistance of E. coli from animals were detected in Shandong Province， and the antibiotic resistance genes and virulence genes were analyzed in multiple high antibacterial strains. E. coli strains from animals was selected from the strain bank of Shandong Veterinary antibiotic resistance monitoring system （Varms）. The sensitivity test of 10 antibiotics was carried out by agar dilution method， and the resistance spectrum of more than 5 multiple drug resistant strains was analyzed. Multiple antibiotic resistance strains with high MICs were selected for MLST typing， and 21 common drug resistance genes and 15 virulence genes were detected by PCR. The results showed that about 20% of the strains were resistant to more than 5 drugs， 32 strains were resistant to 9～10 antibiotics and the MICs was much higher than the R value. The coexistence of 7～13 drug resistance genes and 0～6 virulence genes was detected in all 32 strains， in which the resistance genes with the highest detection rate of β-lactams， quinolones and chloramphenicols were mediated by plasmids; fimC， sitA， iucD and hlyF were the main factors of virulence genes， and the detection rate is 40% ～ 90%. E. coli strains with both resistance and virulence would pose a serious public health threat and huge potential harm to food safety.

Keywords： ?E. coli; Multiple antibiotic resistance; Antibiotic resistance genes; Virulence genes

*基金項目：山東省重大科技創(chuàng)新工程項目“針對超級細菌的獸用噬菌體新獸藥和新添加劑研發(fā)應用”（2019JZZY010719）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系“家禽創(chuàng)新團隊環(huán)境控制崗位專家”（SDAIT-011-09）;山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大創(chuàng)新任務“臨沂市農(nóng)牧廢棄物循環(huán)利用與公共衛(wèi)生監(jiān)測提升工程”（CXGC2022A27）。

作者簡介：劉玲紅（ 1991—） ，女，碩士研究生，主要從事預防獸醫(yī)學研究，E-mail： 1074150258@ qq.com。

**通信作者：胡明（1972—），女，副研究員，博士，主要從事畜牧業(yè)微生物研究，E-mail：may_lake@163.com;

并列通信作者：劉玉慶（1969—），男，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)微生物研究，E-mail： liuiuqing@163.com。