劉雨瑩，張嬌珍，周海娟，潘芳蝶，黎才麗，鐘昌寶

據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，在全球范圍內(nèi)乙型肝炎病毒(HBV)感染人數(shù)超過(guò)3.5億，其中約75%發(fā)生在亞太地區(qū)。由于HBV持續(xù)感染和復(fù)制，肝組織炎癥持續(xù)性發(fā)展，進(jìn)一步惡化可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌[2]?？共《局委熆捎行б种艸BV DNA復(fù)制，延緩疾病發(fā)展。臨床上，抗HBV藥物主要包括α-干擾素類(lèi)和核苷(酸)類(lèi)。替諾福韋作為核苷酸類(lèi)藥物在抑制HBV復(fù)制，降低病毒載量方面效果顯著，可有效恢復(fù)慢性乙型肝炎(CHB)患者肝功能，改善組織炎癥壞死，阻止或減少肝硬化和肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用于CHB患者的抗病毒治療[3，4]。然而，由于近年用藥群體增加、用藥時(shí)間延長(zhǎng)、低耐藥屏障藥物大量使用，使得藥物耐藥問(wèn)題也日益突出。感染HBV后患者多樣化表現(xiàn)是HBV基因多態(tài)性、環(huán)境、人體遺傳因素等因素共同作用的結(jié)果[5]。有研究表明[6]，HBV 基因型與病毒變異、HBeAg表達(dá)、抗病毒應(yīng)答、肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等相關(guān)。我國(guó)HBV以B基因型和C基因型感染為主，約占國(guó)內(nèi)慢性HBV感染者的94%。本研究探討了應(yīng)用替諾福韋治療不同HBV基因型的CHB患者，觀察了療效情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年1月～2020年11月我院診治的CHB患者119例，男76例，女43例；年齡為18～65歲，平均年齡為(36.7±4.5)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，血清HBsAg陽(yáng)性6個(gè)月以上，HBV DNA水平大于1×105copies /mL，血清天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平大于60 U/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平大于60 U/L，納入患者均為核苷或核苷酸類(lèi)似物初治患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝癌及其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾??；合并自身免疫性疾??；合并肺結(jié)核；對(duì)本研究治療藥物過(guò)敏者；入院治療前3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過(guò)其他免疫調(diào)節(jié)或抗病毒治療；妊娠或哺乳期婦女；重疊其他肝炎病毒感染。入組對(duì)象簽署知情同意書(shū)，本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 給予替諾福韋[葛蘭素史克(天津)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20153090]300 mg口服，1次/d，持續(xù)治療觀察48 w。在治療過(guò)程中，不應(yīng)用其他抗HBV藥物、降酶藥物或免疫調(diào)節(jié)劑等。

1.3 血清HBV基因分型 采用QIAamp DNA Mini Kit 提取血清DNA，引物設(shè)計(jì)：上游5′-AGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3′，下游5′-AAAGGGACTCAAGATGTTGTAC-3′。擴(kuò)增HBV DNA S區(qū)內(nèi)590 bp片段。PCR擴(kuò)增條件： 預(yù)變性(94℃，3 min)、變性(94℃，30 s)、退火(58℃，45 s)、延伸(72℃，45 s)，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。在PCR擴(kuò)增后，采用QIAquick PCR Purification Kit 純化產(chǎn)物，使用 Big Dye Terminator v3． 1cycle sequencing kit 在ABI PRISM 3100 Genetic Analyze上對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)NCBI網(wǎng)站分型窗口比對(duì)獲得基因分型結(jié)果。

1.4 血液指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清HBeAg和HBeAb(廣州中山生物科技)；采用熒光定量PCR 法檢測(cè)血清HBV DNA(上?？寺∩锔呖萍?，最低下限為 1.0×103copies/ml)；使用美國(guó)Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用ELISA法檢測(cè)血清金屬硫蛋白(metallothionein，MT)和白細(xì)胞介素-29(interleukin-29，IL-29)水平；使用流式細(xì)胞儀分析外周血T 淋巴細(xì)胞程序性死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)表達(dá)水平，即取外周血加EDTA抗凝，分為3支試管，一支加入抗CD3-APC、抗CD8-FITC、抗CD4-Per CP抗體和全血50μL；一支加入抗CD3-APC、抗CD8-FITC、抗CD4-Per CP、抗PD-1-PE 抗體和全血50 μL；在第三支試管中加入 抗CD3-APC、抗CD8-FITC、抗CD4-Per CP、抗PD-L1-PE抗體和全血50 μL，渦旋，室溫避光孵育30 min，加入稀釋后的紅細(xì)胞裂解液450 μL，避光孵育15 min，待溶血完全后洗滌，重懸，上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用 BD Cell Quest 軟件分析。

1.5 療效評(píng)估 病毒學(xué)應(yīng)答：血清HBV DNA檢測(cè)不到或低于檢測(cè)下限；生化學(xué)應(yīng)答：指血清ALT 和AST恢復(fù)正常；血清學(xué)應(yīng)答：指血清HBeAg轉(zhuǎn)陰或發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型分布情況 在本組119例CHB患者中，檢出HBV B基因型31例(26.1%)，C基因型77例(64.7%)，B/C 混合基因型11例(9.2%)。

2.2 不同HBV基因型患者基線資料比較 B基因型CHB患者血清ALT和AST水平顯著高于C基因型或B/C混合基因型患者，而血清HBV DNA水平顯著低于C基因型或B/C混合基因型患者(P<0.05，表1)。

表1 不同HBV基因型患者基線資料比較

2.3 不同HBV基因型感染患者療效比較 在治療24 w和48 w，B基因型和C基因型CHB患者血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰率顯著高于B/C基因型(P<0.05，表2)。

表2 不同HBV基因型感染患者療效(%)比較

2.4 不同HBV基因型感染患者血清MT、PD-1和IL-29水平變化的比較 在治療48 w，B基因型CHB患者血清MT水平顯著高于C基因型或B/C基因型(P<0.05)，血清IL-29水平顯著高于C基因型(P<0.05)，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平顯著低于C基因型或B/C混合基因型患者(P<0.05，表3)。

表3 不同HBV基因型感染患者血清MT、PD-1和IL-29水平比較

3 討論

替諾福韋屬于新核苷酸類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，具有廣泛的抗病毒作用[8，9]。細(xì)胞激酶將替諾福韋磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴幚碜饔玫奶嬷Z福韋二磷酸，與5′-三磷酸脫氧腺苷酸形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，整合到病毒DNA后，因3′-羥基缺乏致DNA延長(zhǎng)受阻，病毒復(fù)制被抑制。替諾福韋具有較高的耐藥屏障，被批準(zhǔn)為抗HBV首選藥物之一，亦被認(rèn)為是其他核苷(酸)類(lèi)似物耐藥補(bǔ)救治療方案之一[10，11]。

HBV存在多種基因型。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和分子生物學(xué)技術(shù)等飛速發(fā)展，HBV基因分型也越來(lái)越受到臨床的重視，后者可能與病毒變異和病情關(guān)系密切[12]?？蓪BV分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J型。我國(guó)HBV基因型主要為B型和C 型。這兩種基因型感染的慢性肝病患者病情存在差異，往往C型患者較B 型患者具更嚴(yán)重的肝損傷，C型患者容易發(fā)生晚期纖維化、肝硬化和肝癌[13]。目前，對(duì)于不同基因型HBV感染者肝組織病理學(xué)變化、預(yù)后和對(duì)核苷類(lèi)抗病毒應(yīng)答的研究越來(lái)越多，但各家報(bào)道不一[14]。

本組患者以C基因型感染者為主，其次為B基因型感染者。既往對(duì)亞洲普遍流行的B和C基因型作了大量研究[15]，結(jié)果顯示，相較于B基因型，C基因型患者血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰率低，B基因型患者往往以輕度慢性乙型肝炎為主，C基因型則以失代償期肝硬化為主，B基因型患者預(yù)后普遍較C基因型良好。本研究也顯示B基因型感染患者抗病毒治療24 w后HBV DNA轉(zhuǎn)陰率高于C基因型。C基因型感染患者HBV核心啟動(dòng)子突變率較B型高，而HBV核心啟動(dòng)子突變可提高HBV復(fù)制水平，同時(shí)也與更嚴(yán)重的肝纖維化和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。C基因型病毒具有更強(qiáng)的致病性，易致感染者出現(xiàn)免疫耐受。

MT為體內(nèi)最強(qiáng)羥自由基清除劑之一。當(dāng)肝損傷發(fā)生時(shí)，MT可有效清除體內(nèi)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧和羥自由基，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，間接抑制肝星狀細(xì)胞激活[16，17]。PD-1屬免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白。作為活化T細(xì)胞表面抑制性受體，通過(guò)與PD-L結(jié)合，傳遞免疫抑制信號(hào)，負(fù)向調(diào)節(jié)T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒功能，阻斷PD-1信號(hào)通路，重建T細(xì)胞功能，抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病毒清除[18，19]。IL-29屬Ⅲ型干擾素，在感染病毒的細(xì)胞高度上調(diào)。HBV感染能夠激活I(lǐng)L-29啟動(dòng)子活性，上調(diào)IL-29表達(dá)水平。IL-29在宿主抵御微生物的防御方面起著重要作用[20]。在接受抗病毒治療的CHB患者，監(jiān)測(cè)這些血清和血液指標(biāo)可能有助于判斷病情變化、病毒學(xué)應(yīng)答和最終的病情轉(zhuǎn)歸。檢測(cè)這些指標(biāo)的方法需要標(biāo)準(zhǔn)化，以使結(jié)果具有可信和可比。