何 梅

安徽省宣城市疾控中心檢驗科，安徽宣城 242000

單核細(xì)胞增生李斯特菌是現(xiàn)階段臨床中較為常見的病原菌，也是重要且常見的食源性人畜共患菌[1]。有研究將單核細(xì)胞增生李斯特菌與沙門菌、出血性大腸埃希菌、志賀菌共列為四大重要食源性致病菌[2]。人類李斯特菌病約85%以上主要由單核細(xì)胞增生李斯特菌感染引起，并且對老人、新生兒、免疫功能低下者等造成主要威脅，近年來受感染人群病死率居高不下。有研究指出，機(jī)體在感染單核細(xì)胞增生李斯特菌后會穿過機(jī)體三大免疫障礙，導(dǎo)致腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)、敗血癥[3]。有研究指出，2～42 ℃條件下李斯特菌均可有效生長，對營養(yǎng)需求和要求不高，形成生物被膜，并且可在食品中持續(xù)存在，也是臨床中導(dǎo)致人類李斯特菌病的主要病原菌[4]。有研究指出，生物被膜與80%以上人類細(xì)菌性感染密切相關(guān)，生物被膜指細(xì)菌黏附于非生物或生物表面，分泌并釋放大量纖維蛋白、多糖基質(zhì)、脂質(zhì)蛋白等，將自身包繞在生物被膜內(nèi)，并形成大量細(xì)菌胞外聚合物[5]。在陰暗、潮濕食品加工生產(chǎn)環(huán)境中，以及機(jī)械管道和表面廣泛存在，單核細(xì)胞增生李斯特菌形成包括細(xì)菌可逆和不可逆黏附、初始附著表面、微菌落形成、成熟和脫離過程[6]。有研究指出，單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜具有特殊立體多層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致消毒劑或抗微生物藥物無法達(dá)到內(nèi)層細(xì)菌，誘發(fā)耐藥性，使其無法有效抑菌、殺菌[4]。因此，有效分析食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌株生物被膜形成、藥敏試驗有十分重要的意義。本研究擬選取宣城地區(qū)檢測的食品中分離的單核細(xì)胞增生李斯特菌株作為研究對象，分析生物被膜形成、藥敏試驗及毒力基因檢測結(jié)果，為臨床防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 本研究所用菌株均為分離于宣城地區(qū)各類檢測食品的102株單核細(xì)胞增生李斯特菌，以沙門菌H9812和金黃色葡萄球菌 ATCC25923作為PFGE參考菌株和藥敏質(zhì)控菌株，所有菌株均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜檢測 本研究考察不同溫度、培養(yǎng)基濃度、培養(yǎng)時間、pH值、NaCl濃度、葡萄糖濃度對生物被膜形成的影響，其中考察的不同溫度分別為19、28、37、46 ℃，不同培養(yǎng)基濃度分別為25%、50%、75%、100% BHI培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時間分別為6、12、24、48、72 h，不同pH值分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，不同NaCl濃度分別為5 、15 、25、35 、45 g/L，不同葡萄糖濃度分別為2、12、22、32、42 g/L。采用微孔板定量法對生物被膜形成進(jìn)行測定，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1∶100稀釋菌液，每孔加入200 μL，設(shè)8個復(fù)孔，蓋好蓋子封口，后將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，后將各孔中培養(yǎng)基吸出，生理鹽水漂洗3次，除去未形成生物被膜的浮游菌體，干燥后加入甲醇200 μL，固定30 min后吸除，并使用生理鹽水漂洗3次，待干后加入1%草酸銨結(jié)晶紫溶液200 μL，染色20 min后吸除溶液，使用生理鹽水漂洗4次，干燥后加入95%乙醇200 μL，振蕩脫色20 min，充分脫色后以無菌培養(yǎng)基作為空白對照，并用酶標(biāo)儀對生物被膜562 nm的吸光度值進(jìn)行測定，所有試驗均進(jìn)行3次重復(fù)檢測，取均值。

1.2.2 藥敏試驗 本研究采用微量肉湯稀釋法對食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌株進(jìn)行藥敏試驗，監(jiān)測青霉素、氨芐西林、復(fù)方磺胺甲噁唑、美羅培南、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素8種抗菌藥物。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為藥敏質(zhì)控菌株，參照EUCAST標(biāo)準(zhǔn)和美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)對藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行判斷和評估。

1.2.3 毒力基因檢測 采用PCR對毒力基因進(jìn)行檢測，提取單核細(xì)胞增生李斯特菌株DNA模版，并參照Premix Taq試劑盒說明書進(jìn)行PCR操作和檢測，反應(yīng)體系共25 μL，12.5 μL Premix Taq預(yù)混液，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，2 μL模板，其余使用ddH2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性5 min(94 ℃)、變性30 s(94 ℃)、退火30 s(52 ℃)、延伸60 s(72 ℃)，循環(huán)35次，延伸10 min(72 ℃)，使用毛細(xì)管電泳儀對結(jié)果進(jìn)行檢測并觀察結(jié)果。上、下游引物見表1。

表1 上、下游引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同條件生物被膜形成檢測結(jié)果 隨著培養(yǎng)時間的延長及BHI培養(yǎng)基濃度升高，生物被膜形成率呈明顯升高趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。pH值為7.5、NaCl濃度為5 g/L、葡萄糖濃度為22 g/L、溫度為37 ℃時生物被膜形成率最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同條件生物被膜形成檢測結(jié)果

2.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌藥敏試驗結(jié)果 單核細(xì)胞增生李斯特菌對氨芐西林、美羅培南、青霉素及萬古霉素的敏感率均為100.00%，而對復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素則表現(xiàn)出不同的耐藥性，其中對四環(huán)素耐藥率最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 單核細(xì)胞增生李斯特菌藥敏試驗結(jié)果[ n(%),n=102]

2.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因檢測結(jié)果 單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因iap和inlA陽性率均為100.00%，而prfA、hlyA、plcB陽性率均不足100.00%，其中plcB陽性率最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因檢測結(jié)果(n=102)

3 討 論

近年來，我國各地對食品開展單核細(xì)胞增生李斯特菌株污染和檢測狀況調(diào)查結(jié)果顯示，熟肉類、生肉類、水產(chǎn)品類、家禽類、乳制品類及蔬菜類等多種食品中均可能檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌[7]。許多地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌株污染調(diào)查結(jié)果顯示，生鮮肉類食品是污染率較高的食品[6]。進(jìn)食出現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌株污染的食品是臨床中導(dǎo)致人感染單核細(xì)胞增生李斯特菌的主要因素。生物被膜是細(xì)菌的一種自然生命現(xiàn)象，當(dāng)出現(xiàn)生物被膜后會使細(xì)菌適應(yīng)自然環(huán)境，增強(qiáng)對環(huán)境不利因素的適應(yīng)能力和耐受度，降低堿、酸等的細(xì)菌清除能力[8]。有研究指出，生物被膜的形成是一個動態(tài)過程，其形成能力也是影響耐藥性和致病性的關(guān)鍵因素之一[9]。

單核細(xì)胞增生李斯特菌有較高的形成生物被膜的能力，體外研究結(jié)果顯示，單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜是一種呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高度組織化聚合物，細(xì)菌被緊緊包裹在生物被膜中，細(xì)菌不僅可有效獲取外界營養(yǎng)，還可有效對抗外界不利因素，因此，形成生物被膜使單核細(xì)胞增生李斯特菌致病性及耐藥性均較高[10]。不同溫度條件下，生物被膜形成能力存在明顯差異，相對于37 ℃，在BHI培養(yǎng)基溫度為25 ℃時單核細(xì)胞增生李斯特菌的生物被膜形成能力明顯降低[11]。不同營養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)溫度均會對生物被膜形成能力造成不同程度的影響，其中金黃色葡萄球菌可在胰酶大豆肉湯、37 ℃條件下大量形成生物被膜[12]。在低pH環(huán)境條件下，細(xì)菌可通過壓力生存機(jī)制產(chǎn)生一系列重要的抗酸反應(yīng)，以對外界酸環(huán)境進(jìn)行抵抗。有研究發(fā)現(xiàn)，變形鏈球菌在低濃度蔗糖和棉子糖條件下可通過協(xié)同作用誘導(dǎo)生物被膜形成，并且可在人體牙齒表面聚集，誘導(dǎo)產(chǎn)生齲齒[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過將低濃度的葡萄糖添加到培養(yǎng)基中可有效促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌形成生物被膜，而當(dāng)提高葡萄糖濃度則會明顯抑制蠟樣芽孢桿菌生物被膜的生長[14]。

糖類等多種碳源營養(yǎng)物質(zhì)可促使細(xì)菌分泌纖維蛋白、多糖基質(zhì)等胞外聚合物，有利于細(xì)菌繁殖生長，形成致密生物被膜。一定濃度的糖可增加細(xì)菌間黏附力，使生物被膜形成并聚集而難以脫落，其可能增加細(xì)胞表面疏水性，增強(qiáng)微生物附著和黏附。高濃度葡萄糖環(huán)境中滲透壓加大細(xì)菌生存壓力，降低生物被膜形成量。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后單核細(xì)胞增生李斯特菌會出現(xiàn)致密生物被膜，連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且隨著培養(yǎng)時間延長，生物被膜呈一定聚集疊加狀態(tài)，形成復(fù)雜的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析顯示，100% BHI 培養(yǎng)基濃度、37 ℃、22 g/L葡萄糖濃度、5 g/L NaCl濃度、pH 值為7.5是形成單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜的最適條件。本研究結(jié)果提示，在食品加工過程中應(yīng)盡可能避免出現(xiàn)上述條件，降低生物被膜形成概率，減少微生物殘留。因此，在工作中應(yīng)盡可能保持較低的環(huán)境溫度，縮短加工時間，使用堿性消毒液滅菌消毒，適當(dāng)降低水分含量，增加滲透壓。此外，在實踐工作中還應(yīng)嚴(yán)格沖洗加工環(huán)境、設(shè)備表面等，減少糖分和生物被膜殘留。

細(xì)菌耐藥問題是臨床中廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一，也是現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)，已成為目前全球范圍內(nèi)重大的公共安全問題。單核細(xì)胞增生李斯特菌是主要的食源性致病菌，近年來美國、加拿大、歐盟、日本等均逐漸建立細(xì)菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)，密切監(jiān)測和記錄單核細(xì)胞增生李斯特菌的耐藥性。單核細(xì)胞增生李斯特菌對多種抗菌藥物均具有較高的敏感率。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國單核細(xì)胞增生李斯特菌主要對鹽酸多西環(huán)素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星耐藥，并且可能伴隨出現(xiàn)多重耐藥[15]。本研究結(jié)果顯示，宣城地區(qū)分離自食品的單核細(xì)胞增生李斯特菌對氨芐西林、萬古霉素、青霉素和美羅培南敏感率為100.00%，但對復(fù)方磺胺甲噁唑、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星則出現(xiàn)不同程度的耐藥性，未出現(xiàn)多重耐藥。其中單核細(xì)胞增生李斯特菌對四環(huán)素的耐藥率最高，其可能與近年來動物飼料中出現(xiàn)四環(huán)素添加使用密切有關(guān)，因此，可能導(dǎo)致單核細(xì)胞增生李斯特菌對四環(huán)素的耐藥率較高。單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力基因與致病性密切相關(guān)，作為重要的胞內(nèi)寄生菌，當(dāng)單核細(xì)胞增生李斯特菌出現(xiàn)毒力基因缺失則會導(dǎo)致其致病性明顯降低，甚至可能消失。本研究結(jié)果顯示，大部分單核細(xì)胞增生李斯特菌株中均可檢出iap、inlA、plcB、prfA、hlyA毒力基因，表明宣城地區(qū)分離自食品的單核細(xì)胞增生李斯特菌多具有潛在致病力，少數(shù)單核細(xì)胞增生李斯特菌出現(xiàn)毒力基因丟失現(xiàn)象。

隨著培養(yǎng)時間的延長及BHI培養(yǎng)基濃度升高，單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜形成率呈明顯升高趨勢，pH值為 7.5、NaCl濃度為 5 g/L、葡萄糖濃度為22 g/L、溫度為37 ℃時生物被膜形成率最高，單核細(xì)胞增生李斯特菌對四環(huán)素耐藥率最高，毒力基因plcB陽性率最低。本研究選擇的菌株數(shù)較少，另外檢驗手段較單一，結(jié)果可能會產(chǎn)生一定偏倚，有待后續(xù)進(jìn)行持續(xù)研究追蹤。