楊玉琪，周 磊，賀文芳，楊佩紅，張?jiān)屏?，王美珠，?柯△，劉家云▲

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科； 2.疾病預(yù)防控制科，陜西西安710032

下呼吸道感染的診斷與治療除需要影像學(xué)支持外，還需要病原學(xué)支持，目前臨床常采用無創(chuàng)性痰液檢測方法獲取病原學(xué)依據(jù)。然而，因上呼吸道存在大量定植菌，如草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌、不動(dòng)桿菌及念珠菌等，從而會(huì)對(duì)臨床診斷及治療造成干擾[1]。有研究表明，相對(duì)于常規(guī)痰液培養(yǎng)，通過支氣管鏡灌洗獲取的下呼吸道深部標(biāo)本，可以有效避免上呼吸道定植菌的干擾，肺泡灌洗液中分離出的細(xì)菌，可以更明確地為臨床診斷提供依據(jù)，對(duì)臨床治療也更具有指導(dǎo)意義[2]。但值得注意的是，支氣管鏡是一種有可能為患者帶來一定損傷的侵入性操作，而且也因其具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、材料特殊、管腔清洗具有死角等特點(diǎn)，可能會(huì)發(fā)生清洗、消毒不徹底，從而導(dǎo)致醫(yī)源性感染傳播的情況[3-4]。本研究在持續(xù)監(jiān)測本院肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，2次肺泡灌洗液肺炎克雷伯菌(KP)集中被檢出，通過分析患者基本情況、菌株抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果及應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法對(duì)菌株進(jìn)行分型分析，以期根據(jù)菌株間是否具有同源性發(fā)現(xiàn)其傳播流行規(guī)律，從而為可疑院內(nèi)感染發(fā)生提供有效的判斷和預(yù)防控制依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收集KP菌株23株，其中第一批(2020年3月25日至3月28日)11株分離自肺泡灌洗液標(biāo)本，編號(hào)為1～11；第2批(2020年8月29日至9月2日)11株分離自肺泡灌洗液標(biāo)本，編號(hào)為21～31，第2批還有1株分離自1號(hào)支氣管鏡管腔內(nèi)。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、GN細(xì)菌鑒定卡片、AST-GN13細(xì)菌藥敏卡片；Mueller-Hinton培養(yǎng)基；K-B藥敏紙片擴(kuò)散法所用藥敏紙片；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR所用試劑；Beckman DU800核酸蛋白分析儀；ABI 2720 PCR擴(kuò)增儀；DNA凝膠電泳系統(tǒng)；凝膠電泳成像系統(tǒng)。

1.3 質(zhì)控菌株 肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、大腸埃希菌ATCC 25922均購自中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.4 方法

1.4.1 抗菌藥物藥敏試驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)分離細(xì)菌，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行操作；采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)復(fù)核(亞胺培南和美羅培南)及其他補(bǔ)充藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判斷參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)2020年標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4.2 細(xì)菌DNA提取 采用QIAamp DNA純化試劑盒對(duì)分離純化得到的對(duì)數(shù)生長期單菌落進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，并用Beckman DU800核酸蛋白分析儀檢測DNA純度和濃度，確保提取的DNA質(zhì)量。

1.4.3 MLST方法 參照pasteur數(shù)據(jù)庫推薦的引物，選取7個(gè)獨(dú)立管家基因構(gòu)建肺炎克雷伯菌MLST研究方案，分別為rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB[5]，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。將提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一條帶后，送上海生工生物工程股份有限公司測序，采用BioEdit軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行校正、拼接。將各管家基因拼接后的結(jié)果在pasteur數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，從而獲得所對(duì)應(yīng)的7個(gè)管家基因的等位基因型，進(jìn)一步將其組合可獲得菌株ST型別。

1.4.4 內(nèi)鏡清洗消毒效果監(jiān)測 依據(jù)《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB 15982-2012》[6]進(jìn)行采樣并檢測。支氣管鏡采樣部位為內(nèi)腔面，取清洗消毒后的支氣管鏡，用無菌注射器抽取50 mL含相應(yīng)中和劑的洗脫液，從活檢口注入沖洗內(nèi)鏡管路，全量收集后2 h內(nèi)送檢。取充分混合后的洗脫液1 mL接種平皿，清潔用水、在用消毒液使用中和劑中和后，接種方法相同。再取15～20 mL冷卻至40～45 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿中，冷卻凝固后置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 2次集中分離的23株KP對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和碳青霉烯類等抗菌藥物均敏感，且具有相同的耐藥表型。23株KP對(duì)各抗菌藥物敏感結(jié)果見表1。

表1 KP對(duì)21種抗菌藥物的敏感結(jié)果

2.2 KP的MLST結(jié)果 23株KP經(jīng)過MLST后共得到10種ST型別。第1批分離的11株KP以ST23型為主(5株)，其余6株分別為ST374、ST1265、ST2159、ST347、ST65、ST86；第2批分離出的12株KP以ST375為主(10株)，其余2株分別為ST268、ST412；各管家基因序列及各ST型別分離菌株數(shù)見表2。

表2 KP的MLST結(jié)果

2.3 資料分析 22例患者初步診斷以可疑肺炎、肺部占位待查、肺結(jié)核待查為主，其中男12例，女10例，未見明顯性別差異；年齡29～69歲，平均(53.1±11.2)歲。本院支氣管鏡檢查治療室目前在用的支氣管鏡共4個(gè)，分別編為1～4號(hào)，其中第1批11株KP菌株在使用了4個(gè)支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中分別檢出，以ST23型為主，共5株(45.5%,5/11)，且該5例患者均使用的是2號(hào)支氣管鏡；第2批11株KP除2株分離自2例使用了2號(hào)、3號(hào)支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中，其余9例均分離自使用了1號(hào)支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中，且均為ST375型(81.8%,9/11)；第2批采樣的1號(hào)支氣管鏡管腔內(nèi)也分離出ST375型KP。22例患者肺泡灌洗液分離KP 菌株ST型別及其使用支氣管鏡編號(hào)情況見表3。

表3 KP菌株ST型別分離情況

3 討 論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種內(nèi)鏡診療技術(shù)在臨床的應(yīng)用逐漸普遍化，隨之帶來的因內(nèi)鏡下檢查與治療所致的感染也時(shí)有報(bào)道[7-8]。做好內(nèi)鏡清洗、消毒工作，在預(yù)防和控制患者醫(yī)院獲得性感染中起至關(guān)重要的作用,防止交叉感染將成為21 世紀(jì)內(nèi)鏡檢查面臨的重大問題[9]。

肺泡灌洗液是通過將纖維支氣管鏡插入氣道，使用無菌生理鹽水反復(fù)灌洗病變部位后，回收到的肺泡表面襯液[10]，其用于病原微生物學(xué)檢查，可有效避免上呼吸道定植菌群污染，從而能有效分離并確定感染病原菌，對(duì)合理選擇用藥方案有積極的指導(dǎo)意義[11]。本研究2次集中分離的23株KP其菌落均有高黏性特征，并且對(duì)所做的21種抗菌藥物均呈高度敏感性，所以單從菌落特征和藥敏試驗(yàn)表型來看，并不能區(qū)分其是否具有相關(guān)性及同源性。MLST用作細(xì)菌分型，通過對(duì)菌株ST型別及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，可以判斷菌株間的同源性，其作為暴發(fā)流行的溯源工具，具有較高的準(zhǔn)確性和分辨率，且可重復(fù)性好[12-13]。本研究針對(duì)2次集中分離出的23株KP采用MLST方法進(jìn)行型別分析，以期發(fā)現(xiàn)其是否具有同源性。MLST結(jié)果顯示，第1批分離出的11株KP，其中有5株(45.5%)均為ST23型，短期內(nèi)發(fā)現(xiàn)同一ST型別KP的高比率檢出，且該5例患者使用的均是同一個(gè)支氣管鏡(2號(hào)支氣管鏡)，提示可能存在器械性檢查操作所造成的院內(nèi)感染。然而遺憾的是，同時(shí)對(duì)在用的4個(gè)支氣管鏡的各段管腔、清潔用水、在用消毒液分別進(jìn)行采樣培養(yǎng)，均未從中分離出KP。支氣管鏡因管腔內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，采樣難度高，從而造成監(jiān)測結(jié)果有假陰性的可能，然而集中分離出同一型別同一菌株的情況，應(yīng)引起院內(nèi)感染監(jiān)測的重視。持續(xù)觀察期間，第2批分離出的12株KP(包括1號(hào)支氣管鏡管腔)，其中使用了1號(hào)支氣管鏡的9例患者分離出的KP菌株均為ST375型(81.8%)，且該次同時(shí)對(duì)在用的4個(gè)支氣管鏡的各段管腔、清潔用水、在用消毒液分別進(jìn)行了采樣培養(yǎng)和調(diào)查分析，從1號(hào)支氣管鏡管腔內(nèi)分離出的KP菌株為ST375型，可以看出其具有同源相關(guān)性，提示確實(shí)存在器械性檢查操作所造成的院內(nèi)感染。對(duì)2次集中病例進(jìn)行初步診斷可以看出，2次集中從肺泡灌洗液中分離的KP，首例患者均初步診斷為肺炎，考慮其肺部存在KP感染，可能造成檢查過程中對(duì)支氣管鏡的污染，從而導(dǎo)致器械性檢查操作所造成的其他患者發(fā)生院內(nèi)感染。KP作為一種可以定植于人體呼吸道和消化道的條件致病菌，會(huì)在機(jī)體抵抗力下降時(shí)引發(fā)肺部感染、血流感染等。據(jù)報(bào)道，KP引起的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染逐年增加，而近幾年關(guān)于KP引起的醫(yī)院獲得性感染的增加主要與各種器械性操作和創(chuàng)傷性診療技術(shù)增多有關(guān)[14]。

針對(duì)此次疑似支氣管鏡院內(nèi)感染的發(fā)生，醫(yī)院感染專職人員和微生物室進(jìn)行共同采樣及檢測，并在采樣的同時(shí)對(duì)支氣管鏡清洗、消毒的方式和流程，以及所使用的清洗消毒液種類和清洗消毒時(shí)間等也進(jìn)行了調(diào)查監(jiān)測。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，本院對(duì)支氣管鏡不耐熱部位的消毒采用的是高水平消毒液鄰苯二甲醛，懷疑使用該消毒液對(duì)支氣管鏡管腔進(jìn)行浸泡時(shí)發(fā)生了消毒效果不良事件。鄰苯二甲醛作為一種用于處理不耐熱醫(yī)療器械的高水平消毒液，使用時(shí)應(yīng)將器械完全浸入20 ℃以上的鄰苯二甲醛消毒液最少5 min，灌滿所有管腔并排除氣泡，以消滅所有致病微生物。在消毒之前，必須完全清洗污染的可重復(fù)使用的器械，因?yàn)闅埩舻暮形蹪n或潤滑油的污染物會(huì)降低消毒劑的有效性；每次使用前應(yīng)使用鄰苯二甲醛消毒液濃度測試試紙確認(rèn)鄰苯二甲醛的濃度應(yīng)符合要求(有效消毒濃度應(yīng)不低于0.3%)；同時(shí)，使用期間建議使用溫度計(jì)和定時(shí)器確保符合最佳條件[15]。支氣管鏡消毒合格率要達(dá)到100%具有一定的難度，支氣管鏡使用后，及時(shí)、徹底、規(guī)范清洗，可有效阻止生物膜形成，是保證支氣管鏡消毒成功的關(guān)鍵和基礎(chǔ)[7]。提高清洗、消毒工作人員的操作規(guī)范性，加強(qiáng)支氣管鏡清洗、消毒效果監(jiān)測，同時(shí)結(jié)合分子分型方法等檢測手段，可以確保支氣管鏡等內(nèi)鏡的消毒質(zhì)量，從而有效降低或阻止院內(nèi)感染發(fā)生。