田 瑩， 張國(guó)城， 李晶晶， 劉佳琪， 潘一廷，吳 丹， 沈上圯， 霍勝偉

(北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院國(guó)家生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)治理產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100029)

1 引 言

目前涌現(xiàn)出了一批熒光法生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀、生物氣溶膠采樣器等設(shè)備，而這些設(shè)備缺少相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)方法[1～5]。為了對(duì)相關(guān)設(shè)備進(jìn)行評(píng)價(jià)，需要模擬環(huán)境，產(chǎn)生具有特定種類、濃度和分布的生物氣溶膠[6]。市場(chǎng)上存在的多種生物氣溶膠霧化器，通過撞擊、剪切流動(dòng)、氣泡爆裂等過程將大量流體分解成液滴，將生物分子由溶液霧化到環(huán)境中，形成相對(duì)穩(wěn)定的生物氣溶膠[7～10]。

氣動(dòng)霧化是最常用的霧化微生物的方法，其利用流速大、壓強(qiáng)小的原理制成[11～13]。氣動(dòng)霧化可以產(chǎn)生高濃度的氣溶膠，但同時(shí)由于強(qiáng)大的撞擊力和剪切力會(huì)傷害和破碎微生物[14,15]。細(xì)胞懸液的頻繁再循環(huán)，在長(zhǎng)時(shí)間霧化過程中也會(huì)增加細(xì)菌的碎裂[16]。

市場(chǎng)上生物氣溶膠生成設(shè)備眾多，對(duì)于儀器的性能包括產(chǎn)生的生物氣溶膠濃度，細(xì)菌可培養(yǎng)性和結(jié)構(gòu)完整性等仍然缺乏相關(guān)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究的主要目標(biāo)是系統(tǒng)地分析生物氣溶膠發(fā)生器在產(chǎn)生的顆粒濃度和尺寸分布以及細(xì)菌細(xì)胞損傷方面的性能，根據(jù)可培養(yǎng)性和細(xì)胞膜完整性的損失來評(píng)估對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的損害，從而選擇合適的生物氣溶膠霧化器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液的準(zhǔn)備

本研究選用革蘭氏陰性菌大腸桿菌作為測(cè)試菌種。大腸桿菌(ATCC 15597)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)之前，將大腸桿菌在50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)過夜;然后，細(xì)菌用無菌去離子水洗滌2次，在7 000g相對(duì)離心力下離心5 min;之后，將大腸桿菌重懸于無菌去離子水中，qPCR結(jié)果細(xì)菌濃度為108CFU/mL。

2.2 測(cè)試系統(tǒng)

本研究主要測(cè)試了兩種氣壓霧化器：ZR霧化器和FK霧化器，其中，ZR是傳統(tǒng)的利用氣動(dòng)原理的霧化器，F(xiàn)K是常見的商品化的霧化瓶。圖1展示的是實(shí)驗(yàn)的流程圖和霧化器的原理圖。所有的實(shí)驗(yàn)在生物安全柜中進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有的裝置進(jìn)行紫外滅菌30 min。在實(shí)驗(yàn)過程中，利用粒徑譜儀(TOPAS LAP322)監(jiān)測(cè)混合倉(cāng)內(nèi)大腸桿菌生物氣溶膠的尺寸分布和濃度。TOPAS LAP322是基于光散射法的粒子測(cè)量?jī)x器，可以提供0.2～40 μm氣溶膠粒徑測(cè)量范圍。生物氣溶膠采用BioSampler(SKC Inc.)收集，收集液為5 mL的無菌去離子水。采樣流量為12.5 L/min，采集時(shí)間為 10 min。采集完之后劇烈渦旋300 s，混勻所收集的樣品，然后向兩個(gè)EP離心管(1.5 mL)中各加入1 mL液體進(jìn)行樣品分析。ZR的進(jìn)氣流量分別為5，7，9 L/min，F(xiàn)K霧化器的進(jìn)氣流量分別為1，2，3 L/min。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Experimental flow chart

2.3 細(xì)菌破損比例

大腸桿菌生物氣溶膠的數(shù)量濃度基于直徑大于0.523 μm的顆?？倲?shù)濃度[16]。對(duì)于產(chǎn)生的大腸桿菌生物氣溶膠，破損的比例為：

式中：C1即為破損的細(xì)菌濃度，粒徑范圍在0.363～0.555 μm，小于 0.5 μm的細(xì)菌顆粒被認(rèn)為來自受損細(xì)菌的碎片，而0.363 μm是粒徑譜儀能檢測(cè)到的細(xì)胞碎片的下限[17]；C2為總的數(shù)濃度。

2.4 細(xì)菌的可培養(yǎng)率

可培養(yǎng)的細(xì)菌個(gè)數(shù)通過平板法獲得。取100 μL的采集液梯度稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)16 h，形成肉眼可見的菌落，通過肉眼計(jì)數(shù)得到菌落個(gè)數(shù)，并根據(jù)采樣體積計(jì)算測(cè)量艙中可培養(yǎng)菌的濃度Cculturable。樣品總的細(xì)菌數(shù)Ctotal通過qPCR獲得。因此，大腸桿菌懸液的可培養(yǎng)率為：

相對(duì)于新鮮的菌液，采集的微生物氣溶膠樣品的細(xì)菌可培養(yǎng)率比例的減少，用CR表示：

式中：η1是大腸桿菌經(jīng)過霧化，BioSampler采集后大腸桿菌的可培養(yǎng)率；η2是新鮮的大腸桿菌菌液的可培養(yǎng)率。

2.5 細(xì)胞膜損傷指數(shù)

文獻(xiàn)[16]中指出，細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)在霧化和采樣過程中可能會(huì)受損，導(dǎo)致DNA作為游離分子釋放到采集液中，同時(shí)引入細(xì)胞膜損傷指數(shù)來量化損傷。膜損傷指數(shù)I為膜損傷細(xì)菌細(xì)胞釋放的16S rRNA基因與樣本中16S rRNA基因總量的比率，變化從“0”(無損傷)到“1”(細(xì)菌的所有基因組DNA均被釋放)。

式中：Ns指的是在采樣液上清中的16S rRNA基因拷貝數(shù)的濃度；Np指的是采樣液離心后沉淀樣品中的16S rRNA的基因拷貝數(shù)濃度。

由于霧化的大腸桿菌使用相同的采樣條件(BioSampler采集)，細(xì)胞膜損傷指數(shù)可以用來比較不同氣溶膠發(fā)生器在霧化過程中對(duì)細(xì)菌施加的壓力。將BioSampler采集的液體取1 mL轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL離心管中，在16 000g相對(duì)離心力下離心10 min。然后將950 μL上清液轉(zhuǎn)移到新的無菌1.5 mL離心管中，同時(shí)對(duì)剩余的含有細(xì)胞沉淀的50 μL液體進(jìn)行DNA提取。在離心后的樣品中，上清液中的DNA來自失去膜完整性的細(xì)胞，而沉淀中的DNA來自保持膜完整性的細(xì)胞。

2.6 DNA提取和定量PCR

探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可以對(duì)總的生物氣溶膠濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，靈敏度和特異性極高[18]。將上清和沉淀的樣品通過細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302，天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，最終溶解到50 μL的超純水中。

正向引物:

5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′

反向引物:

5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′

探針:

(6-FAM)-5-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′-(TAMRA)

反應(yīng)體系為50 μL。包括:5 μL DNA模版；1 μL 10 mmol/L的引物；1 μL 10 mmol/L的探針；25 μL的2×Taq PCR預(yù)混合液(KT201，天根生化科技有限公司)；17 μL的超純水。整個(gè)qPCR實(shí)驗(yàn)在羅氏LightCycler 480儀器上進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。所有的引物和探針都是由上海生工生物工程有限公司合成。超純水作為qPCR實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。

2.7 數(shù)據(jù)的分析

本研究使用Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。使用單因素方差分析不同進(jìn)氣流量對(duì)破損比例，細(xì)胞膜損傷指標(biāo)，可培養(yǎng)率比例的減少量的影響。p值小于0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大腸桿菌氣溶膠霧化后的粒徑分布

為了探索不同進(jìn)氣流量對(duì)霧化器產(chǎn)生的生物氣溶膠粒徑的影響，我們利用粒徑譜儀對(duì)大腸桿菌氣溶膠粒徑進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。如圖2所示，ZR霧化器產(chǎn)生的生物氣溶膠峰值對(duì)應(yīng)的粒徑大小為0.932 μm，而FK霧化器產(chǎn)生的大腸桿菌氣溶膠粒徑直徑為1.071 μm，很可能是因?yàn)镕K霧化器在霧化的過程中濕度更高，導(dǎo)致產(chǎn)生的顆粒物粒徑更大[6]。本研究選擇的進(jìn)氣流量是這兩種霧化器的常用流量，可以觀察到FK霧化器產(chǎn)生的顆粒物個(gè)數(shù)相對(duì)于ZR的霧化器數(shù)濃度更高，而且整體霧化的氣溶膠濃度會(huì)隨著流量的增大而增高，但對(duì)生物氣溶膠峰值所對(duì)應(yīng)的粒徑大小沒有明顯的影響。

圖2 不同霧化器產(chǎn)生的大腸桿菌氣溶膠的粒徑大小分布Fig.2 Particle size distribution of E.coli aerosol produced by different atomizers

單獨(dú)霧化超純水時(shí)，粒徑譜儀在0.203～0.266 μm的讀數(shù)有明顯的增加。而粒徑大小范圍在0.363～0.555 μm的碎片很可能是在霧化過程中細(xì)胞經(jīng)歷了強(qiáng)烈的機(jī)械應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞破碎，因此用來評(píng)價(jià)不同霧化器的性能[19]。如圖3所示(圖中ZR-n，F(xiàn)K-n中的n代表進(jìn)氣流量為n,單位L/min)當(dāng)ZR霧化器的流量從5 L/min增加到7 L/min，9 L/min時(shí)，相應(yīng)的細(xì)菌破損比例F為(15.67±0.58)%，(15.33±2.08)%，(19.33±0.58)%，其中流量為5 L/min和7 L/min之間沒有明顯差異，而當(dāng)進(jìn)氣流量為9 L/min時(shí)，破損比例F顯著高于另外兩組。可能是因?yàn)殪F化引起的機(jī)械應(yīng)力越強(qiáng)，細(xì)菌在氣霧化過程中破碎成碎片的機(jī)會(huì)就越大，加上容器內(nèi)的液體再循環(huán)，霧化器中的細(xì)菌會(huì)受到反復(fù)的剪切力和撞擊力。這與圖2的結(jié)果相一致，霧化產(chǎn)生的顆粒物個(gè)數(shù)在9 L/min時(shí)更為明顯。同樣地，F(xiàn)K霧化器的進(jìn)氣流量為1 L/min和2 L/min時(shí)，破損比例F基本相當(dāng)，而流量為3 L/min時(shí)，F(xiàn)增加到(23.00±2.83)%。

圖3 霧化器在不同進(jìn)氣流量下的破損比例Fig.3 The damage ratio of the atomizer under different intake air flow

3.2 細(xì)胞膜損傷指數(shù)

采用間接方法通過計(jì)算每個(gè)樣品的I值來評(píng)估細(xì)胞膜損傷的程度[14]。BioSampler采集液中檢測(cè)到的游離DNA可能是由于氣溶膠化和采樣壓力共同造成的[14]。由于BioSampler在所有實(shí)驗(yàn)中的工作條件相同，因此它對(duì)細(xì)胞膜損傷指標(biāo)的貢獻(xiàn)是一定的，最終I值的差異很可能是由于霧化過程造成的。生物氣溶膠發(fā)生器對(duì)大腸桿菌菌液施加壓力，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，基因組DNA作為游離DNA分子釋放到采集液中。如圖4所示，當(dāng)進(jìn)氣流量增加時(shí)，ZR霧化器的I值明顯增加，表明霧化對(duì)細(xì)胞膜完整性產(chǎn)生了顯著影響，這與細(xì)菌破損比例的結(jié)果相一致，表明細(xì)菌在霧化過程中，當(dāng)進(jìn)氣流量增加到一定程度，壓力變得足夠大時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生破損，導(dǎo)致基因組DNA在內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)成分被釋放并霧化為游離顆粒；而FK霧化器在進(jìn)氣流量增加到3 L/min時(shí)，I值沒有顯著的變化，可能是霧化瓶本身結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)導(dǎo)致的差異。

圖4 霧化器在不同進(jìn)氣流量下的細(xì)胞膜損傷指數(shù)Fig.4 The cell damage index of the nebulizer under different intake air flow

3.3 可培養(yǎng)率的變化

空氣傳播的微生物根據(jù)其生理狀態(tài)可以分為可培養(yǎng)、可存活但不可培養(yǎng)、不可存活但保持膜完整性和細(xì)胞碎片。因此，可培養(yǎng)性的變化也是評(píng)價(jià)霧化器性能的重要指標(biāo)之一。如圖5所示，當(dāng)進(jìn)氣流量為5 L/min時(shí)，ZR霧化器發(fā)生的氣溶膠可培養(yǎng)率比值的減少量CR達(dá)到90%以上，并且隨著流量增加到97.78%。同樣地，F(xiàn)K霧化器的CR值從低流量的94.00%增加到高流量的99.24%。進(jìn)一步證明了經(jīng)過霧化和采樣的過程，細(xì)菌的存活狀態(tài)發(fā)生了明顯變化，可培養(yǎng)性嚴(yán)重降低[10, 20]。很大程度上是因?yàn)樵陟F化和撞擊器壁期間，具有細(xì)胞膜的微生物反復(fù)暴露于剪切力，可能被損壞或失去活力，并且降解過程依賴于所施加的壓強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌大腸桿菌相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)機(jī)械應(yīng)力更為敏感，因此在霧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)更易受損[21]。

圖5 霧化器在不同進(jìn)氣流量下的可培養(yǎng)率的變化Fig.5 The change of the cultivable rate of the atomizer under different intake air flow

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)室生物氣溶膠旨在受控的環(huán)境條件下模擬大氣生物氣溶膠的特性，有助于更好地了解微生物在空氣中的傳播。在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生生物氣溶膠具有一定的局限性，通常無法復(fù)制生物多樣性； 但對(duì)于生物采樣器效率、暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及針對(duì)生物氣溶膠防護(hù)技術(shù)的有效性都有著重要意義。

本研究探討了不同氣溶膠發(fā)生器在產(chǎn)生的顆粒數(shù)量濃度和尺寸分布、細(xì)菌可培養(yǎng)性損失和細(xì)胞破碎方面的差異，這在很大程度上取決于每個(gè)設(shè)備的結(jié)構(gòu)。大粒徑顆粒的產(chǎn)生很可能是由于高濕度導(dǎo)致的，吸濕性生長(zhǎng)或者多個(gè)細(xì)菌顆粒團(tuán)聚導(dǎo)致細(xì)胞大小不同。小粒徑顆粒則是因?yàn)殪F化過程對(duì)微生物的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破碎從而產(chǎn)生，并且細(xì)菌碎片比例F值和細(xì)胞膜破損指數(shù)I值隨著進(jìn)氣流量的增加而增加。

本課題對(duì)生物氣溶膠發(fā)生器的選擇提供參考依據(jù)，不僅需要考量生物氣溶膠的物理特性(例如粒子數(shù)濃度、尺寸分布)，更要關(guān)注其生物參數(shù)(例如可培養(yǎng)性和結(jié)構(gòu)完整性)。一些霧化器內(nèi)的懸浮菌液隨著不斷的循環(huán)而受到反復(fù)的剪切和撞擊應(yīng)力，氣溶膠發(fā)生時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)菌的損傷越嚴(yán)重，因此需要避免長(zhǎng)時(shí)間的霧化。不同的生物氣溶膠類型由于大小形狀各異，在霧化效率、結(jié)構(gòu)完整性和霧化過程中的存活能力方面可能表現(xiàn)不同。因此，在未來的研究中，有必要對(duì)霧化不同生物氣溶膠類型時(shí)各種霧化器的性能進(jìn)行研究。