張芯悅，梁 坤，沈國晴，馮清源，李光建，傅丹敏，胡安冉，汪萌芽，黃宏平

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.啟明星小組；2.生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

抑郁癥又稱抑郁障礙,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征[1]，是一種嚴(yán)重危害公眾健康的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者常伴有認(rèn)知功能損害,主要表現(xiàn)為注意力、學(xué)習(xí)記憶及執(zhí)行功能等障礙[2]，其中學(xué)習(xí)記憶功能是認(rèn)知活動(dòng)中的重要方面。近年來，許多臨床工作者對(duì)中醫(yī)藥治療抑郁癥引發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙的療效及可能的作用機(jī)制的研究指出，抗抑郁的中藥制劑在某些認(rèn)知功能的改善上優(yōu)于西藥[3],這可能為中醫(yī)藥治療抑郁癥開辟了一條新途徑。抑郁癥在我國中醫(yī)學(xué)中屬于“郁證”范疇，越鞠丸作為治療郁證的代表方劑，在臨床上還具有支持快速持久抗抑郁的作用[4]。有研究者基于新穎物體識(shí)別范式實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)越鞠丸醇提物可以調(diào)節(jié)強(qiáng)迫游泳模型小鼠應(yīng)激誘導(dǎo)的記憶障礙[5]，提示越鞠丸可能成為新的治療應(yīng)激誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的潛在藥物。本研究進(jìn)一步探究越鞠丸對(duì)慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)導(dǎo)致抑郁樣行為模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，為抗抑郁中藥治療應(yīng)激導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量160～190 g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 儀器和藥品 44 cm×44 cm×47 cm大鼠曠場實(shí)驗(yàn)箱(Panlab，USA)，Y型迷宮(MG-2型迷宮刺激器)由張家港市教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠提供，Morris水迷宮水池由實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)自制[6]，越鞠丸購自安徽省亳州市譙城區(qū)華佗鎮(zhèn)華佗拾遺中醫(yī)館。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將28只雄性SD大鼠(160～190 g)分為正常組(n=9)、抑郁組(n=10)和越鞠丸組(n=9)。根據(jù)動(dòng)物給藥劑量換算公式與越鞠丸使用說明書，大鼠每日劑量為3 g/kg。將越鞠丸放入超純水中，使用磁力攪拌器進(jìn)行溶解，配置越鞠丸溶液。越鞠丸組與抑郁組造模完成后，對(duì)越鞠丸組持續(xù)21 d灌胃給藥越鞠丸溶液(1 mL/100 g)，正常組和抑郁組灌胃給予相同劑量的超純水(1 mL/100 g)。

1.3.2 CUS導(dǎo)致抑郁樣行為模型大鼠制備 根據(jù)曠場實(shí)驗(yàn)評(píng)分將大鼠分組[7]，選擇得分高的9只大鼠作為正常組，其余隨機(jī)分為抑郁組和越鞠丸組，并對(duì)其進(jìn)行抑郁樣行為模型制備，即孤籠飼養(yǎng)的同時(shí)連續(xù)3周進(jìn)行CUS，包括24 h禁食、24 h禁水、24 h潮濕墊料、5 min水平搖晃、4℃冰水浴5 min、夾尾1 min、電擊30 min，每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)2次。

1.3.3 CUS導(dǎo)致抑郁樣行為模型大鼠鑒定

1.3.3.1 糖水偏愛實(shí)驗(yàn) 在文獻(xiàn)[8]方法上稍加變動(dòng)，正式測試前訓(xùn)練大鼠飲用濃度為2%的糖水。訓(xùn)練結(jié)束后斷水24 h開始測試，給予每只大鼠兩瓶容量為100 mL的水壺，分別為糖水和純凈水，2 h后對(duì)水壺余量進(jìn)行稱量，計(jì)算每只大鼠的糖水偏愛率。

1.3.3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 依次將每只大鼠放入曠場箱，測試時(shí)長為5 min，實(shí)驗(yàn)人員在旁記錄，當(dāng)大鼠4只爪同時(shí)爬入一格中計(jì)為水平得分1分，當(dāng)大鼠2只前爪同時(shí)騰空遠(yuǎn)離地面計(jì)為垂直得分1分，分別統(tǒng)計(jì)水平和垂直分?jǐn)?shù)[9]，最后計(jì)算總得分。

1.3.4 空間學(xué)習(xí)記憶檢測

1.3.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 將水池等分成4個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)前一天依次將每只大鼠放至可視平臺(tái)適應(yīng)15 s，結(jié)束后換成透明不可視平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠背向平臺(tái)、面向池壁自4個(gè)象限的標(biāo)記點(diǎn)隨機(jī)放入，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，連續(xù)5 d重復(fù)上述步驟。在最后一天的定位航行結(jié)束1 h后撤掉平臺(tái)，將大鼠隨機(jī)從任一象限標(biāo)記點(diǎn)背向水池置入池中1次，記錄大鼠1 min內(nèi)到達(dá)目標(biāo)象限所需的時(shí)間、在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和穿越虛擬平臺(tái)的次數(shù)[10]。

1.3.4.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 由3條臂[42 cm×15 cm×13 cm(長×寬×高)]組成。隨機(jī)將3條臂分成起始臂、其他臂與新異臂，實(shí)驗(yàn)前3 d關(guān)閉新異臂，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)環(huán)境。正式測試時(shí)，將新異臂打開，依次將大鼠自起始臂放入，記錄5 min內(nèi)每只大鼠進(jìn)入3條臂的次數(shù)、順序與停留時(shí)間[11]。

2 結(jié)果

2.1 抑郁樣行為模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化

2.1.1 大鼠經(jīng)CUS刺激后的行為學(xué)表現(xiàn) 與正常組相比，抑郁組與越鞠丸組的體質(zhì)量[抑郁組與越鞠丸組(243.09±16.99)g，正常組(385.14±20.63)g，t=19.298，P=0.000]、糖水偏愛率[抑郁組與越鞠丸組(0.70±0.24)%，正常組(0.87±0.05)%，t=2.077，P=0.048]、曠場實(shí)驗(yàn)總得分(抑郁組與越鞠丸組43.32±23.07，正常組76.89±13.22，t=4.037，P=0.000)均有下降，顯示造模成功。

2.1.2 大鼠經(jīng)CUS刺激后空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化 在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，抑郁組、越鞠丸組與正常組相比，自主交替率降低[抑郁組與越鞠丸組(0.10±0.11)%，正常組(0.26±0.14)%，t=3.433，P=0.002]、新異臂停留時(shí)間縮短[抑郁組與越鞠丸組(93.58±48.21)s，正常組(189.78±68.36)s，t=3.798，P=0.003]，新異臂潛伏期延長[抑郁組與越鞠丸組(13.68±7.33)s，正常組(7.00±4.72)s，t=2.903，P=0.008]，說明慢性應(yīng)激刺激對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力造成損傷。

2.2 越鞠丸對(duì)抑郁樣行為模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 抑郁樣行為模型大鼠給予越鞠丸21 d后行為學(xué)指標(biāo)的變化 在曠場實(shí)驗(yàn)中，越鞠丸組(42.67±11.12)與正常組總得分(50.78±13.56)均高于抑郁組(30.20±10.42)(P<0.05)。抑郁組的體質(zhì)量[(397.29±21.57)g]較正常組[(450.93±37.86)g]降低(P<0.05)，而3組在糖水偏愛率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明越鞠丸有一定的抗抑郁作用(圖1)。

2.2.2 給藥后越鞠丸組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化

2.2.2.1 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 越鞠丸組較抑郁組自主交替率[越鞠丸組(0.26±0.17)%，抑郁組(0.08±0.14)%、起始臂進(jìn)入次數(shù)(越鞠丸組2.00±0.71，抑郁組1.00±0.82)和總進(jìn)臂次數(shù)(越鞠丸組8.11±1.54，抑郁組5.80±2.66)均增加(P<0.05)。抑郁組較正常組自主交替率(0.29±0.14)%、起始臂進(jìn)入次數(shù)(2.67±1.00)和總進(jìn)臂次數(shù)(9.00±2.35)均降低(P<0.01)(圖2)。

A.F=5.533，P=0.010；B.F=9.325，P=0.001；C.F=5.175，P=0.013。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在水迷宮空間探索階段中，越鞠丸組較抑郁組目標(biāo)象限停留時(shí)間延長[越鞠丸組(29.22±4.49)s，抑郁組(24.50±4.20)s，P<0.05]，穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)增加(越鞠丸組6.56±1.33，抑郁組4.30±0.95)(P<0.01)，顯示越鞠丸對(duì)抑郁模型大鼠的記憶能力具有改善作用(圖3)。

A.F=5.220，P=0.013；B.F=9.124，P=0.001。*P<0.05.**P<0.01。

3 討論

CUS可較好地復(fù)制抑郁癥的發(fā)病誘因[12]，尤其是環(huán)境因素，該模型動(dòng)物的行為表現(xiàn)符合抑郁癥患者的核心癥狀[13]，同時(shí)模型可維持3個(gè)月，是一種理想可靠的造模方法[14]，因此本研究采用該方法制備抑郁模型，并使用曠場實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛實(shí)驗(yàn)兩項(xiàng)行為學(xué)測試鑒定造模是否成功。本研究結(jié)果顯示，和正常組大鼠相比，抑郁組與越鞠丸組在曠場中總活動(dòng)次數(shù)減少，與抑郁癥患者動(dòng)作遲緩的癥狀相似，攝入糖水量的降低體現(xiàn)了興趣減退的特征[13]，同時(shí)伴有體質(zhì)量明顯下降，顯示造模成功。越鞠丸在臨床上具有明顯的抗抑郁療效[4]，實(shí)驗(yàn)中灌胃給藥21 d后的越鞠丸組曠場總得分高于抑郁組，表明越鞠丸能改善CUS所致抑郁大鼠的抑郁樣行為癥狀[5]，這可能依賴于越鞠丸能夠激活PKA-CREB信號(hào)通路使新生神經(jīng)元數(shù)量增加以達(dá)到抗抑郁的效果[15]。

抑郁癥的發(fā)生常伴隨著認(rèn)知功能障礙的出現(xiàn)，其中學(xué)習(xí)記憶的損傷更為明顯[16]。慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶方面的損傷[17]，包括空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶等。Y迷宮是用于觀察大鼠空間記憶能力的常見手段[18]。本研究結(jié)果顯示，造模后抑郁組與越鞠丸組自主交替率、新異臂停留時(shí)間較正常組均減少，新異臂潛伏期延長，說明CUS刺激對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能造成了損傷。給藥后越鞠丸組大鼠在Y迷宮測試中的自主交替率、起始臂進(jìn)入次數(shù)與總進(jìn)臂次數(shù)均增加，說明越鞠丸可以緩解應(yīng)激導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，與其他研究[5,19]中發(fā)現(xiàn)越鞠丸可以改善學(xué)習(xí)記憶損傷的作用結(jié)果一致。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能的方法[18]。本研究結(jié)果顯示，越鞠丸使抑郁樣行為模型大鼠在空間探索階段中穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)增加、目標(biāo)象限停留時(shí)間延長，說明越鞠丸增強(qiáng)了抑郁樣行為模型大鼠的空間記憶能力。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸在改善CUS大鼠抑郁樣行為的同時(shí)也改善了應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷，提示處理抑郁情緒與學(xué)習(xí)記憶能力的神經(jīng)環(huán)路有交叉共享的可能，為未來研究治療學(xué)習(xí)記憶障礙的抗抑郁中藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。