陳欣德，周 帥，張茂容，吳志浩,2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1．腫瘤微環(huán)境研究室;2．醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

通關(guān)藤是蘿藦科牛奶菜屬植物通關(guān)藤的干燥藤莖，有別名稱(chēng)烏古藤、通光散、大苦藤、地甘草、鳥(niǎo)古藤、下奶藤及勒藤，長(zhǎng)2～6米，花開(kāi)在夏季；主要分布在我國(guó)的貴州、云南、四川等地[1]，具有清熱解毒、緩解咳嗽及哮喘、消除疼痛等作用。此外，《云南藥典》和《中華人民共和國(guó)藥典(1977年版)》記載通關(guān)藤可以用于消炎抗癌[2]。通關(guān)藤含有多種化學(xué)成分，包括甾體苷類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)[3]，通關(guān)藤提取物在體外對(duì)肺癌、肝癌、胃癌等癌癥具有抑制作用[4]。目前臨床上用的最多的劑型是消癌平注射液，且大都與一線抗癌藥物如紫杉醇、吉非替尼、順鉑、5-氟尿嘧啶等聯(lián)合用藥。消癌平注射液是由藥用植物通關(guān)藤的干燥藤莖經(jīng)低溫提取、生物分離及高科技離子交換萃取等現(xiàn)代中藥制作提取方法提取而成，保留了藥物中的活性成分。消癌平注射液主要應(yīng)用于化療、放療以及術(shù)后的藥物輔助治療[4]；其毒性非常小，且能在一定程度上提高患者的機(jī)體免疫力，是中藥抗癌的代表之一，在臨床上取得了一定的治療效果。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，消癌平注射液具有治療多種癌癥的臨床背景，但是其具體的抗腫瘤機(jī)制尚不明確。本文研究結(jié)果顯示，消癌平注射液能夠抑制細(xì)胞活力，使細(xì)胞周期停滯并且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用。

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[5]。由于常規(guī)檢查很難發(fā)現(xiàn)肺癌的存在，所以一般發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)患者已處晚期[6]，手術(shù)已很難治愈。雖然近年來(lái)針對(duì)肺癌治療及預(yù)后的研究取得了較大進(jìn)展，但是肺癌的總體生存率還是較低。這是由于肺癌屬于轉(zhuǎn)移性腫瘤，其侵襲性及轉(zhuǎn)移性都很強(qiáng)，常規(guī)治療如手術(shù)、放療、化療等均無(wú)良好的療效。

GSK-3β在多種信號(hào)通路及多種癌癥中扮演著十分重要的角色，其參與信號(hào)的傳導(dǎo)以激活或者抑制下游靶基因的表達(dá)，其參與調(diào)控的凋亡通路中包括NF-κB通路以及線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。在本研究中，我們證明了消癌平注射液通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299的凋亡，這些結(jié)果表明了消癌平注射液可以作為化療以及一線抗癌藥物的輔助藥物的依據(jù)。為今后臨床上關(guān)于腫瘤的藥物治療提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 A549、H1299細(xì)胞(人源非小細(xì)胞肺腺癌上皮細(xì)胞系，ATCC)；HBE細(xì)胞(人正常支氣管樣上皮細(xì)胞，ATCC)。

1.2 藥品與試劑 消癌平注射液(南京圣和藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)202006241，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025868，縮寫(xiě)為XAP)；NF-κB抗體、Actin抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體購(gòu)于CST公司；小牛血清、DMEM(Gibco公司，美國(guó))；GSK-3β抑制劑(Merck公司，美國(guó))；1.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl(pH=6.8)、APS、SDS、麗春紅染液、MTT、TEMED(碧云天公司，中國(guó))；NC膜(PALL公司，美國(guó))；流式細(xì)胞術(shù)試劑盒(凱基生物公司，中國(guó))；鼠抗、兔抗(CST公司，美國(guó))；順鉑(齊魯制藥有限公司，批號(hào)8A001A88，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021357，縮寫(xiě)為DDP)。

1.3 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf公司，德國(guó))；BioTek酶標(biāo)儀(伯騰公司，美國(guó))；離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；金屬浴D1100-230v(Labent AccuBlock公司，美國(guó))；4℃水平搖床(New Brunswick公司，美國(guó))；電泳儀、小型垂直電泳槽(BioRad公司，美國(guó))。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將人非小細(xì)胞肺腺癌A549、H1299細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，放入提前預(yù)熱的37℃水浴鍋中輕輕搖晃，待剩余少許冰塊時(shí)停止搖晃，放入超凈臺(tái)中加入1 mL含10%新生小牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中緩緩打勻。1 500 r/min離心4 min后吸走上清，加入1 mL含有10%新生小牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基打勻，接著打入事先準(zhǔn)備好的含有7～8 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于48孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)饑餓12 h，分別按照以下分組：陰性對(duì)照組，消癌平注射液組(1、2、3、4、5 μg/μL)各組設(shè)4組復(fù)孔。待48 h后，吸去上清液，加入新配制的0.5 μg/mL的MTT溶液每孔400 μL，處理4 h后用移液槍緩慢吸取液體，每孔加入300 μL的二甲亞砜，搖床避光震蕩15 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度。根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率(inhibitor rate，IR)=(對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100%，計(jì)算每組抑制率。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡與周期 將胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)饑餓過(guò)夜，設(shè)置陰性對(duì)照組，加藥組加入消癌平注射液(5 μg/μL)處理24 h，陽(yáng)性對(duì)照組加入順鉑(10 μmol/L)處理5 h。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，再用1 mL PBS清洗1次，取得細(xì)胞分為凋亡組與周期組。凋亡組:加入400 μL 1×Binding Buffer 將細(xì)胞打勻，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI染液。輕輕打勻并在室溫下黑暗中孵育15 min。周期組:用75%的冰乙醇水溶液固定過(guò)夜，加入450 μL的PI染液和50 μL的RNase A溶液，輕輕打勻后避光靜置30 min。所得樣品經(jīng)過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用Flowjo軟件分析。

1.4.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并接種于6孔板，待6孔板中細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，饑餓12 h。分別加入0、1、2、3、4、5 μg/μL的消癌平注射液處理24 h后收樣，使用LaemmLi sample buffer裂解液收集細(xì)胞，進(jìn)行電泳跑膠轉(zhuǎn)膜封閉，所剪的蛋白條帶在4℃低溫?fù)u床中孵育對(duì)應(yīng)的一抗過(guò)夜后，TBST洗膜(每次5 min，洗3次)，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，再次洗膜(每次5 min，洗3次)，最后進(jìn)行曝光(AI600化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影)。

1.4.5 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞鋪于6孔板中至密度達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)青鏈霉素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 min后轉(zhuǎn)染cDNA和siRNA，6～8 h后更換為普通培養(yǎng)基，36 h后用DMEM饑餓處理12 h，加入不同濃度的消癌平注射液處理24 h。NF-κB siRNA的正義鏈序列為5′GCGACAGGUGCAGA-AAGAdTdT3，反義鏈序列為3′dTdTCGCUGUUCCACGUCUUUCU5。

2 結(jié)果

2.1 消癌平注射液對(duì)A549、H1299、HBE細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，與0 μg/μL組相比，在A549細(xì)胞系中，濃度達(dá)2 μg/μL后隨消癌平注射液濃度梯度的增加，對(duì)細(xì)胞均有抑制作用(F=118.90,P<0.05)。在H1299細(xì)胞系中，濃度達(dá)3 μg/μL后隨著消癌平注射液濃度梯度的增加，對(duì)細(xì)胞均有抑制作用(F=29.99,P<0.05)。而不同濃度消癌平注射液對(duì)肺正常上皮細(xì)胞(HBE)抑制差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.97,P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 消癌平注射液對(duì)A549、H1299細(xì)胞凋亡的影響 與陰性對(duì)照組相比，消癌平注射液組與順鉑組早期凋亡細(xì)胞增多(P<0.05)。消癌平注射液組與順鉑組早期凋亡細(xì)胞之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 消癌平注射液對(duì)A549、H1299細(xì)胞周期的影響 與陰性對(duì)照組相比，消癌平注射液組與順鉑組停滯于G0/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)。消癌平注射液組與順鉑組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 消癌平注射液通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸促進(jìn)A549、H1299細(xì)胞的凋亡 Western blot結(jié)果顯示，6孔板內(nèi)分別加入消癌平注射液濃度為0、1、2、3、4、5 μg/μL處理24 h后收樣，GSK-3β表達(dá)量不變，p-GSK-3βSer9、NF-κB、Bcl-2蛋白量下降，Bax蛋白量上升。見(jiàn)圖4。

圖4 消癌平注射液通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸促進(jìn)細(xì)胞的凋亡

2.5 用GSK-3β抑制劑驗(yàn)證消癌平注射液對(duì)A549、H1299細(xì)胞的凋亡作用 向加入消癌平注射液(4 μg/μL)的細(xì)胞中加入GSK-3β抑制劑(20 μmol/L)處理5 h后與未加入GSK-3β抑制劑的細(xì)胞和陰性對(duì)照組相比較，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β的磷酸化水平及下游靶蛋白水平恢復(fù)，說(shuō)明消癌平注射液通過(guò)激活GSK-3β的活性來(lái)抑制下游靶基因的蛋白水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了消癌平注射液對(duì)肺腺癌A549、H1299細(xì)胞的作用機(jī)制(圖7～8)。

圖5 過(guò)表達(dá)GSK-3β cDNA

圖6 轉(zhuǎn)染NF-κB siRNA

圖7 加入GSK-3β抑制劑后下游靶蛋白恢復(fù)

圖8 單獨(dú)加入GSK-3β抑制劑后檢測(cè)其對(duì)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因調(diào)控的一種正常的生物學(xué)過(guò)程，是細(xì)胞的一種程序性死亡[7]。在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)控生物在發(fā)育，進(jìn)化過(guò)程中起重要的作用[8]。而在腫瘤細(xì)胞中，由于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，分化程度低等，為維持腫瘤細(xì)胞的特性，與正常細(xì)胞相比較，有一些基因的表達(dá)量發(fā)生改變，從而引起蛋白水平的改變并最終改變細(xì)胞的特性。

在眾多的凋亡家族基因中，Bcl-2是十分重要的一種抗凋亡因子，其在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。它雖然不影響細(xì)胞增殖，但是可以阻滯細(xì)胞的凋亡[9]。Bcl-2與促凋亡因子Bax相互拮抗，可結(jié)合成為異源二聚體[10]，拮抗細(xì)胞的凋亡。在正常情況下，抗凋亡基因Bcl-2抑制細(xì)胞的凋亡，而當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，促凋亡基因Bax會(huì)被釋放到并轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，提高線粒體膜通透性而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞的凋亡[11]。

NF-κB是1986年發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，最常見(jiàn)的是p65與p50結(jié)合形成的二聚體。它的作用為通過(guò)抵抗細(xì)胞凋亡而使腫瘤細(xì)胞存活，其作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)范圍較廣。而先前的研究報(bào)道中有研究者證明Bcl-2的啟動(dòng)子上有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[12]，再根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在蛋白水平上Bcl-2隨著NF-κB下降而下降，進(jìn)一步證明了NF-κB能夠調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)。

GSK-3β，一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種雙特異性激酶，已被視為多種人類(lèi)癌癥的潛在治療靶點(diǎn)。在不同的癌癥以及不同的信號(hào)通路中GSK-3β扮演的角色不同。當(dāng)?shù)?位的絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化以后會(huì)導(dǎo)致GSK-3β的活性受到抑制。而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB的活性又受到GSK-3β激活的調(diào)節(jié)[13-14]，我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)p-GSK-3βSer9下降，所以我們猜想消癌平注射液可能通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549、H1299的凋亡。為了驗(yàn)證消癌平注射液是否通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸調(diào)控細(xì)胞的凋亡，本研究又引入了GSK-3β的抑制劑進(jìn)一步證明了消癌平注射液通過(guò)GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549、H1299的凋亡。

總之，消癌平注射液促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549、H1299的凋亡，其機(jī)制是通過(guò)調(diào)控GSK-3β-NF-κB-Bcl-2軸來(lái)發(fā)揮作用。