胡旭峰，王 林

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)在臨床中極為常見，可引起患者感覺退化和自主功能喪失，給患者工作和生活帶來極大不便[1-2]。研究證實(shí)，周圍神經(jīng)在損傷后具有修復(fù)再生的能力，因此，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生成為當(dāng)前的醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一[3-4]，深入研究周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)機(jī)制成為其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究顯示，絲蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB亦稱作AKT)信號通路作為具有多個磷酸化調(diào)控位點(diǎn)的信號通路，在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其可通過與雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)作用介導(dǎo)周圍神經(jīng)再生，有研究認(rèn)為mTOR的減少與中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力下降有關(guān)，mTOR可介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)和再生[5-7]，蛋白激酶N2(protein kinase N2,PKN2)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，其激酶活性區(qū)域位于c端[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)PKN2能促進(jìn)小鼠胚胎發(fā)育和神經(jīng)嵴遷移，是神經(jīng)再生和神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵步驟[8]，PKN2可通過調(diào)控AKT/mTOR通路促進(jìn)PC12細(xì)胞再生[9]，然而，PKN2通過AKT/mTOR通路能否調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)周圍神經(jīng)再生尚不清楚。因此，本研究擬確定PKN2在PNI修復(fù)中的作用機(jī)制，為PNI的治療提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級SD大鼠50只，重組人PKN2蛋白(美國Abcam)，兔抗大鼠PKN2、AKT、mTOR單抗隆抗體(美國Abcam)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗、PCNA免疫熒光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，DAPI和抗熒光衰減封片劑(武漢谷歌)，甲苯胺藍(lán)染色液(美國Sigma)，電泳儀(美國BIO-RAD)，倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)，Sartoris天平(德國Sartoris)。

1.2 坐骨神經(jīng)損傷模型制備 50只大鼠均腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，用無齒鑷鉗夾坐骨神經(jīng)，每次10 s，間隔30 s，重復(fù)5次，抗生素抗感染治療，隨后逐層縫合肌肉、皮膚。正常對照組10只大鼠不做任何處理。

1.3 PKN2干預(yù)方法 模型制備成功后3周，麻醉后暴露神經(jīng)，模型大鼠分為4組，每組10只，模型組注射5 μL PBS，重組PKN2(rhPKN2)低、中、高劑量組：Hamilton微量注射器在損傷處由遠(yuǎn)側(cè)到近側(cè)分別緩慢注射10 ng/μL的rhPKN2 5 μL、10 μL和20 μL。每周1次，連續(xù)注射4周。

1.4 大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)(sciatic nerve index，SFI)測定 大鼠于干預(yù)后每周進(jìn)行步態(tài)分析，準(zhǔn)備50 cm長、8 cm寬的長方形盒子，避光處理，白紙平整鋪于底部，大鼠雙側(cè)后足底均勻涂抹墨水，盒內(nèi)自由行走，分別記錄健側(cè)(E)與患側(cè)(N)的足印長度(podogram length,PL)、足趾寬度(width between the first and fifth toes,TW)和中間足趾距離(inter-toes distance,IT)。坐骨神經(jīng)指數(shù)計(jì)算公式為：SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8[10]。

1.5 股三頭肌肌濕重測量 切取麻醉大鼠患側(cè)與健側(cè)股三頭肌，稱重，計(jì)算術(shù)側(cè)與健側(cè)質(zhì)量比，比值越小，代表肌肉萎縮越明顯。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色觀察髓鞘結(jié)構(gòu) 取大鼠坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端，4℃環(huán)境下，2.5%戊二醛固定過夜，1%四氧化鋨固定2 h，乙醇脫水，石蠟包埋，制備1 μm厚度的切片，0.5%的甲苯胺藍(lán)染色30 min，隨后水洗，20%醋酸浸泡，水洗3次，封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.7 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況 組織切片經(jīng)脫蠟和脫水，隨后于PBS中浸泡，甩干多余水分，加100 μL蛋白酶K(1∶1 000稀釋于10 mmol/L Tris-CL中)，室溫孵育20 min;PBS清洗5 min×3次；分別加入50 μL TUNE混合液，37℃搖床避光孵育1 h；PBS清洗5 min×3次，滴加DAPI工作液室溫避光孵育30 min；PBS清洗5 min×3次，加入防熒光淬滅劑，封片；熒光顯微鏡下觀察致密高亮的紅色熒光細(xì)胞核與對應(yīng)的DAPI藍(lán)色熒光細(xì)胞，合并后呈粉紅色的則為凋亡細(xì)胞核。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況 收集各組坐骨神經(jīng)組織，RIPA裂解。離心后取上清，依據(jù)BCA法測定蛋白濃度。以GAPDH作為內(nèi)參，SDS-PAGE電泳。隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉1 h，TBST清洗3次，應(yīng)用PKN2、AKT和mTOR單克隆抗體一抗在4℃孵育過夜。最后使用辣根過氧化酶二抗(1∶5 000)孵育并加入ECL顯色液顯色成像。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠SFI比較 與正常組相比，模型組大鼠SFI均下降(P<0.05)；與模型組相比，各劑量組SFI均增加(P<0.05)；與低、中劑量組相比，高劑量組SFI增加(P<0.05)，見圖1。

2.2 各組大鼠股三頭肌肌濕重比較 與正常組相比，模型組肌濕重比值下降(P<0.05)；與模型組相比，各劑量組肌濕重比值均增加(P<0.05)；與低、中劑量組相比，高劑量組肌濕重比值增加(P<0.05)，見表1。

與正常組相比，&P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與低、中劑量組相比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠神經(jīng)纖維再生情況比較 與正常組相比，模型組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量減少(P<0.05)；與模型組相比，各劑量組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量均增加(P<0.05)；與低、中劑量組相比，高劑量組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量增加(P<0.05)，見表1。

2.4 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較 與正常組相比，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量增加(P<0.05)，與模型組相比，各劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量均減少(P<0.05)；與低、中劑量組相比，高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少(P<0.05)，見表1。

2.5 各組大鼠蛋白表達(dá)情況比較 與正常組相比，模型組PKN2、AKT和mTOR蛋白下調(diào)(P<0.05)，與模型組相比，各劑量組PKN2、AKT和mTOR蛋白均上調(diào)(P<0.05)；與低、中劑量組相比，高劑量組PKN2、AKT和mTOR蛋白上調(diào)(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠三頭肌濕重、有髓神經(jīng)纖維數(shù)量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)比較

3 討論

PNI是常見臨床疾病，其損傷后可激活神經(jīng)元天然的再生能力，從而修復(fù)再生神經(jīng)斷端的軸突。修復(fù)PNI的關(guān)鍵是保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)軸突再生[11]，然而，周圍神經(jīng)軸突的再生過程極其復(fù)雜，牽涉到眾多過程，其具體機(jī)制尚未明確。因此，加強(qiáng)再生機(jī)制的研究，有助于提供有效的潛在治療靶點(diǎn)。

PKN2是一種蛋白激酶c相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種細(xì)胞通路中作為多個氨基酸單亞基信號多肽效應(yīng)因子。PKN2在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)錄激活信號通路中起重要作用[12-13]。最新研究發(fā)現(xiàn)PKN2能促進(jìn)小鼠胚胎發(fā)育和神經(jīng)嵴遷移，是神經(jīng)再生和神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵步驟[8]。研究表明PKN2可以通過結(jié)合突觸后密度蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸酶結(jié)合，PKN2還具有Sr3同源性3(SRC homology3 domain,SH3)結(jié)構(gòu)域，SH3結(jié)構(gòu)域是Rho信號通路的潛在效應(yīng)部位[14]。本課題組前期研究顯示，PNI模型大鼠中PKN2呈低表達(dá)，并且與AKT和mTOR蛋白呈正相關(guān)，而AKT/mTOR通路在神經(jīng)損傷中呈現(xiàn)異常表達(dá)，已有充足的研究證據(jù)表明該通路參與中樞神經(jīng)的損傷過程[15]，且PKN2具有靶向調(diào)節(jié)AKT/mTOR通路的作用[9]。因此，為進(jìn)一步探究PKN2在PNI中的作用機(jī)制，本研究采用經(jīng)典方法制備PNI模型，并用重組PKN2蛋白注射，以提高PKN2蛋白水平，觀察其對運(yùn)動功能和神經(jīng)再生指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示模型組大鼠SFI較正常組大鼠明顯下降，而給予重組PKN2蛋白后，SFI增幅明顯優(yōu)于模型組，且呈劑量效應(yīng)，表明重組PKN2蛋白可以有效改善損傷后的運(yùn)動功能，肌濕重比值亦可反映肌肉萎縮情況，重組PKN2蛋白干預(yù)后大鼠肌肉萎縮得到明顯逆轉(zhuǎn)，亦能間接證明重組PKN2蛋白對神經(jīng)元的恢復(fù)發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。通過甲苯胺藍(lán)染色新生髓鞘數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析損傷后再生的神經(jīng)纖維，客觀直接判斷重組PKN2蛋白對神經(jīng)纖維再生的影響，本研究顯示重組PKN2蛋白可促進(jìn)有髓神經(jīng)纖維的再生數(shù)量，明顯促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和再生。凋亡速度亦是反映損傷神經(jīng)再生的重要指標(biāo)，本研究顯示，重組PKN2蛋白明顯抑制了神經(jīng)元的凋亡，有利于神經(jīng)元成熟和再生。最后，為驗(yàn)證PKN2對AKT/mTOR通路的影響，Western blot結(jié)果顯示，其在注射重組

PKN2后明顯上調(diào)，表明PKN2對AKT/mTOR通路具有直接的調(diào)控作用，進(jìn)一步表明PKN2通過對AKT/mTOR通路的調(diào)控促進(jìn)了PNI后神經(jīng)元的分化和再生能力，為PNI的治療提供了理論依據(jù)。