沈鏈鏈， 劉艷青， 管強東

(南京醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院， 江蘇 南京 211166)

流式細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)是一項應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的細胞分離與純化技術(shù)[1]。目前常規(guī)細胞分選除了流式細胞分選技術(shù)外，還有密度梯度離心法和免疫磁珠分離法。相對于其他兩種技術(shù)，流式細胞分選技術(shù)具有高通量、分選速度快、分選細胞純度高活性好等技術(shù)優(yōu)勢[2-4]。隨著細胞生物學和生物醫(yī)學工程技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀已成為科研領(lǐng)域和臨床診斷中不可缺少的設(shè)備[5]。在PubMed上使用“Fluorescence-activated cell sorting”作為關(guān)鍵詞檢索文獻，有關(guān)流式細胞分選方面的文獻與日俱增，如圖1所示，由此可見流式細胞分選儀得到了越來越多使用和研究。

圖1 PubMed上檢索“Fluorescence-activated cell sorting”文獻統(tǒng)計Fig.1 Search for “Fluorescence-activated cell sorting” literature statistics on PubMed

流式細胞分選儀在實際運行中受到多種因素的制約，如儀器性能、操作手法和細胞狀態(tài)[1, 6]，并且分選的每個步驟和儀器參數(shù)的設(shè)置都會對細胞的活性、純度以及分選速度產(chǎn)生較大影響[7]。目前有研究報道不同型號的噴嘴以及分選模式均會對細胞的純度及活性有較大的影響[2, 8-9]。分選主要分為試管式分選和96孔板分選，對于試管式分選來說，得率、純度和活性這3個主要評價指標很難同時兼顧，應(yīng)根據(jù)后續(xù)實驗的要求采用不同的分選方案。對于96孔板分選來說，單細胞入孔率和克隆形成率是2個重要評價指標，已有研究表明不同分選條件對單細胞入孔率和克隆形成率有較大影響[8]，同一條件下對于不同樣本的單細胞入孔率和克隆形成率也有較大差異[10]，應(yīng)采用合適的分選方案才能同時保證單細胞入孔率和克隆形成率。

樣本的制備(主要是細胞濃度及狀態(tài)、活性)，流式細胞儀參數(shù)、噴嘴尺寸的選擇是保障高分選效率和高分選純度的重要因素，但這需要豐富的經(jīng)驗和一定的技巧，而目前相關(guān)報道很少，只有一些理論或經(jīng)驗之談，缺乏系統(tǒng)的研究。因此，有必要結(jié)合實際情況系統(tǒng)地研究各個環(huán)節(jié)對分選產(chǎn)生的影響，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)針對不同的樣本及需求制定符合實際工作且高效個性化的分選方案，為后續(xù)工作提供高質(zhì)量符合要求的細胞。胃癌細胞BGC-823是一種低分化的并且被廣泛使用的貼壁上皮樣細胞，其大小適中、狀態(tài)穩(wěn)定、可傳代次數(shù)好。因此文章以BGC-823細胞為例，探索流式細胞分選的參數(shù)選擇和條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材 料

FACS AriaⅢ流式細胞分選儀，Accudrop微球和鞘液(均為美國Becton Dickinson公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；胰酶、培養(yǎng)基以及細胞培養(yǎng)所需材料(均為美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)的BGC-823細胞用胰酶消化，離心后用無血清培養(yǎng)基將細胞濃度分別調(diào)整為1×106，5×106，1×107個/mL，用篩孔尺寸為50 μm的濾網(wǎng)過濾于流式管中。

1.2.2 儀器調(diào)試

打開儀器開關(guān)以及電腦軟件，安裝提前超聲處理過的85 μm或100 μm噴嘴，點擊Stream啟動主液流，液流穩(wěn)定后調(diào)節(jié)振幅Ampl和頻率Freq，使液流斷點處于窗口中上部，并使Gap值趨于穩(wěn)定。點擊Sweet Spot鍵，使液流穩(wěn)定在設(shè)定狀態(tài)。配制Accudrop微球，點擊Auto Delay自動調(diào)試液滴延遲時間，側(cè)液流液滴比例99%以上為最佳。

1.2.3 96孔板單細胞分選

在Device Setup界面選擇96孔板，并點擊Go to Home鍵使載物臺移動到默認位置，加裝96孔板，調(diào)節(jié)左側(cè)液流使其從防濺孔中心穿過并落在A1孔蓋板中心位置，若未落在A1孔中心，則對載物臺位置進行調(diào)節(jié)。為了精確定位，還需將細胞預分選到孔板蓋上，選取96孔板每一排的前中后3個孔，每個孔分選50個細胞，分選完后觀察蓋板上的液滴是否在每個孔的中心位置，若不在則需要微調(diào)載物臺位置。位置調(diào)節(jié)完后，取下蓋板，每個孔預先加入150 μL培養(yǎng)液，用single cell模式每個孔分選1個細胞。用同樣方法對85 μm和100 μm噴嘴，以及不同濃度1×106，5×106，1×107個/mL的細胞進行分選。分選完成后，立刻蓋上蓋板，4 h后，在熒光顯微鏡下觀察微孔中細胞群落中綠色熒光較亮的單個細胞的孔數(shù)，再放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后觀察克隆形成的情況。

1.2.4 試管式分選

安裝試管分選架，在流式管中提前加入1 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)側(cè)液流電壓使側(cè)液流正好落在流式管中液面的中心位置。先用85 μm和100 μm兩種不同噴嘴進行分選，后對1×106，5×106，1×107個/mL 3種濃度以及用4-way purity，purity，yield，initial和fine tune 5種模式進行分選。每一次分選均分出1×105個細胞，記錄分選時間，分選完后按照檢測設(shè)門的條件回測細胞純度(記錄5 000個細胞)，將剩余細胞均勻地鋪在60 mm的培養(yǎng)皿中放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后熒光顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 噴嘴的選擇

不同直徑的噴嘴對96孔板分選的單細胞入孔率和克隆形成率都有一定影響，以及對試管式分選的純度和活性也有影響。不同噴嘴分選后結(jié)果見表1，分選培養(yǎng)后細胞狀態(tài)如圖2所示。用85 μm噴嘴進行96孔板分選時平均單細胞入孔率為(72.9±1.8)%，平均克隆形成率為(46.2±3.9)%，進行試管式分選后平均純度為(71.3±1.8)%，培養(yǎng)7 d后細胞形態(tài)完整，有克隆形成，熒光相對較弱；用100 μm噴嘴進行96孔板分選時平均單細胞入孔率為(74.6±1.6)%，平均克隆形成率為(54.0±1.8)%，進行試管式分選后平均純度為(81.1±1.7)%，培養(yǎng)7 d后細胞狀態(tài)較好，細胞數(shù)量較多，熒光較強。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立重復實驗的平均值±標準誤差。

表1 不同噴嘴分選后結(jié)果比較Table 1 Comparison of the results of different nozzles after sorting

(a) 85 μm

(b) 100 μm圖2 85 μm噴嘴和100 μm噴嘴試管式分選培養(yǎng)后細胞狀態(tài)Fig.2 Cell states after different nozzle test-tube sorting and culture with 85 μm and 100 μm nozzle

2.2 細胞濃度的選擇

不同濃度的細胞對分選的效率和純度有一定的影響。對濃度為1×106個/mL細胞進行96孔板分選時，平均單細胞入孔率為(74.6±2.6)%，平均克隆形成率為(56.3±2.1)%，進行試管式分選后平均純度為(82.4±1.2)%，分選時間為(24.7±1.3) min，培養(yǎng)7 d后細胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強；對濃度為5×106個/mL細胞進行96孔板分選時平均單細胞入孔率為(74.6±1.6)%，平均克隆形成率為(54.0±1.8)%，進行試管式分選后平均純度為(81.1±1.7)%，分選時間為(5.0±0.5) min，培養(yǎng)7 d后細胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強；對濃度為1×107個/mL細胞進行96孔板分選時平均單細胞入孔率為(70.5±2.2)%，平均克隆形成率為(52.7±1.8)%，進行試管式分選后平均純度為(77.6±1.7)%，分選時間為(3.3±0.2) min，培養(yǎng)7 d后細胞狀態(tài)較好，有克隆形成，熒光較弱。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立重復實驗的平均值±標準誤差，見表2和圖3。

表2 不同濃度細胞分選后結(jié)果比較Table 2 Comparison of the results of different concentrations of cells after sorting

(a) 1×106個/mL

(b) 5×106個/mL

(c) 1×107個/mL圖3 不同濃度細胞試管式分選培養(yǎng)后的細胞狀態(tài)Fig.3 Cell states at different concentrations after test-tube sorting and culture

2.3 試管式分選模式的選擇

不同的分選模式影響分選效率和分選純度。用4-way purity，purity，yield，initial和fine tune 5種模式進行分選后平均純度分別為(81.1±1.7)%，(80.4±1.1)%，(77.3±2.5)%，(76.4±1.0)%，(80.6±1.4)%。培養(yǎng)7 d后，4-way purity，purity和fine tune 3種模式細胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強；yield和initial 2種的模式細胞形態(tài)完整，有克隆形成，但熒光較弱。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立重復實驗的平均值±標準誤差，見表3和圖4。

表3 不同分選模式細胞分選后結(jié)果比較Table 3 Comparison of the results of different sorting modes after cell sorting

(a) 4-way purity

(b) Purity

(c) Yield

(d) Initial

(e) Fine tune圖4 不同分選模式試管式分選培養(yǎng)后細胞狀態(tài)Fig.4 Cell states in different sorting mode after test-tube sorting and culture

3 討 論

流式細胞分選技術(shù)以高通量、耗時短、多參數(shù)、無污染等優(yōu)勢被廣泛用于細胞的分選和純化，其分選后的細胞能繼續(xù)培養(yǎng)或者直接用于移植、提取核酸、原位雜交、單細胞PCR擴增等[9, 11-13]。流式細胞分選儀是通過振蕩的噴嘴將液流分裂成均勻的小液滴，原則上每個液滴只包含一個細胞，通過儀器的多參數(shù)設(shè)置，包含目的細胞的液滴可被充以正負電荷，當液滴流經(jīng)電壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生偏轉(zhuǎn)落入微孔板或收集管中[5, 14]。

流式細胞分選的結(jié)果受多種因素的影響，如儀器的狀態(tài)、樣品的狀態(tài)、噴嘴的選擇和分選模式的選擇。儀器狀態(tài)對分選結(jié)果影響較大的主要有液流的連續(xù)性和穩(wěn)定性以及液滴延遲的調(diào)節(jié)。液流的不穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)不當會使儀器無法正確抓取目標細胞，從而降低分選效果。為保證液流的連續(xù)性和穩(wěn)定性應(yīng)做到以下幾點：每次開機前，首先要檢查鞘液過濾器，若過濾器中有氣泡應(yīng)先排除氣泡，若過濾器堵塞要及時更換；其次要對噴嘴進行超聲清洗防止噴嘴小孔堵塞，安裝噴嘴時保證O型密封圈的密封性，不要大幅度上下移動；清潔電壓偏轉(zhuǎn)板確保無鹽結(jié)晶殘留；觀察流動室有無氣泡，若有氣泡可以反復開關(guān)液流啟動按鈕排除氣泡；根據(jù)不同的噴嘴設(shè)定準確適當?shù)恼穹鵄mpl和頻率Freq值；開啟液流后要使液流穩(wěn)定30 min，排除環(huán)境因素導致的液流不穩(wěn)定。液滴延遲是細胞從被檢測到被分選所經(jīng)過的時間差，要實現(xiàn)精確的分選，則必須得到準確的液滴延遲值。雖然FACS AriaⅢ流式細胞分選儀具備自動調(diào)試液滴延遲的功能，但在調(diào)試前應(yīng)使4路模擬分選液流能被激光均等照亮，否則會使分液流和中心液流照度不同，從而影響液滴延遲的設(shè)置[1]。

噴嘴的選擇是分選的基礎(chǔ)，一般要求噴嘴的直徑為樣本細胞直徑至少3倍以上，小噴嘴對應(yīng)的流速和振蕩頻率較大，形成的液滴小而多，可能存在液滴對細胞包裹不全的情況，導致分選后細胞受損甚至形成細胞碎片；大噴嘴形成的液滴較大，分選時形成的鞘液壓力更低，但是會存在一個液滴包裹多個細胞的情況，在某些分選模式下會影響細胞的回收率。綜合考慮之下，85 μm和100 μm噴嘴使用較多，研究中探討這兩種噴嘴對BGC-823細胞分選的影響。85 μm和100 μm噴嘴單細胞入孔率都在70%以上且沒有差異，但是85 μm噴嘴克隆形成率只有46.2%，相對較低。這可能和鞘液的壓力有關(guān)，85 μm噴嘴的鞘液壓力為0.31 MPa，而100 μm噴嘴的鞘液壓力只有0.17 MPa，大的鞘液壓力影響了細胞活性從而會導致克隆形成率的下降。用85 μm噴嘴進行試管式分選后的細胞純度只有71.3%，相對100 μm噴嘴的81.1%較低。大的鞘液壓力不僅會使細胞活性降低甚至會使部分細胞受損從而形成細胞碎片導致分選后純度降低。

樣本的制備(主要是細胞濃度及狀態(tài)、活性)對細胞分選的結(jié)果也起著關(guān)鍵性作用。有研究發(fā)現(xiàn)濃度越小的細胞懸液，其液流越穩(wěn)定，并且單位時間內(nèi)有更少的細胞被檢測，提高了細胞檢測的靈敏度，從而提高了分選的效率和純度[8, 15]。研究探討1×106，5×106，1×107個/mL 3種濃度對BGC-823細胞試管式分選和微孔板分選的影響。3種濃度對微孔板分選結(jié)果影響不大，單細胞入孔率都在70%以上，克隆形成率都在50%以上，這可能與分選模式有關(guān)，微孔板分選一般選用single cell模式，這種模式可以準確分選計數(shù)并且能更好地分選只包含單個目標細胞的液滴。但對試管式分選來說分選后細胞純度存在差異，細胞濃度越高分選后細胞的純度越低，高濃度的細胞液流越不穩(wěn)定，并且細胞越容易聚集從而進一步影響分選結(jié)果。然而并不是細胞濃度越低越好，對于1×106個/mL和5×106個/mL這2種濃度的細胞來說，分選后細胞純度差別并不大，但是分選所用時間相差很大，1×106個/mL濃度的細胞分選需要24.7 min，而5×106個/mL濃度細胞分選只要5.0 min，綜合考慮選用5×106個/mL濃度細胞進行分選能在保證純度的前提下大大提高了分選效率。除細胞濃度外，細胞的狀態(tài)和活性對分選結(jié)果也有一定影響，分選對樣本的要求是高活性、低雜質(zhì)、少聚集的單細胞懸液。因此最好選用新復蘇的、處于對數(shù)生長期并且活性好的細胞。在黏附細胞的單細胞樣本準備時，需要用胰酶消化使細胞黏附降低從而分離，在此消化過程中時間過長或過短都會影響細胞樣品的質(zhì)量，對于容易聚集的黏附力強的細胞，可以適當加入EDTA來有效防止細胞的聚集。

FACS AriaⅢ流式細胞分選儀具有6種分選模式，分別是single cell，4-way purity，purity，yield，initial和fine tune，每種模式對應(yīng)著不同的算法。single cell模式能準確分選計數(shù)，適用于微孔板分選。purity和4-way-purity模式是保證純度的模式，他們只對包含目的細胞的液滴進行分選，而對摻有非目的細胞的液滴不進行分選，這可能導致細胞回收率的下降。purity常用于2路分選；4-way-purity常用于4路分選，能避免中間2路純度受影響；yield模式更注重于細胞的回收率，會使非目標細胞誤選，導致分選的純度較低；initial模式為drop delay設(shè)定粗調(diào)模式；fine tune為drop delay設(shè)定細調(diào)模式。本研究中4-way purity，purity和fine tune這3種模式細胞分選后純度較高，而yield和initial模式細胞分選后純度相對較低。分選模式根據(jù)分選的目的來定，一般高富集實驗要求高純度的，多選用4-way purity或purity模式，對于后續(xù)實驗對純度要求不高并且細胞數(shù)較少的情況下，為保證細胞回收率可以選擇yield模式。

4 結(jié) 論

對于和BGC-823細胞大小類似的貼壁腫瘤細胞而言，96孔板分選可采用100 μm噴嘴和5×106個/mL細胞濃度能獲得更高的單細胞入孔率和克隆形成率；而對于試管式分選采用100 μm噴嘴、5×106個/mL細胞濃度和4-way purity模式將獲得更高的分選后細胞純度。研究以BGC-823細胞分選條件的優(yōu)化為例，為FACS Aria Ⅲ流式細胞分選儀細胞分選參數(shù)的選擇以及條件的優(yōu)化提供了一定的參考，為后續(xù)工作開展及順利進行做充分保障。