呂金鵬， 姜松周， 李思淇， 張錫梅， 楊 瑩， 宋國(guó)強(qiáng)

(常州大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 常州 213164)

皮膚黑色素在人們正常社會(huì)交往和保護(hù)人們免受紫外線輻射等方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。黑色素產(chǎn)生于黑色素細(xì)胞中的黑色素小體，黑色素成熟之后，由黑色素細(xì)胞的樹突端傳遞到周圍的角質(zhì)層形成細(xì)胞，完成皮膚著色[3-4]。與色素合成有關(guān)的3種關(guān)鍵酶分別為酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(TRP-2)[5-6]。其中TYR是黑色素生成的限速酶，能夠催化生成3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)，TRP-1能與磷酸化的酪氨酸酶形成復(fù)合體，可對(duì)酪氨酸酶的激活起穩(wěn)定作用，TRP-2作為多巴胺互變異構(gòu)物，催化多巴胺重排形成5,6-二羥基吲哚-2-羧酸 (DHICA)[7]。在轉(zhuǎn)錄水平上小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)的M-box促進(jìn)TYR的表達(dá)[8]，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖和存活[9]。在黑色素細(xì)胞中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括p38，ERK和JNK 3條并行的信號(hào)通路，都可以調(diào)控MITF的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞中黑色素合成[10-11]。

甘草是中國(guó)一項(xiàng)寶貴的中藥資源，甘草素(Liquiritigenin)是甘草中重要的黃酮類化合物之一[12]。甘草素具有抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)血管病變、改善纖維化等多種藥理作用[13]，另外其毒副作用較小，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。有研究表明，甘草素可以促進(jìn)B16F10中黑色素合成，但是作用機(jī)制不明確[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)在B16F10細(xì)胞上，探討甘草素調(diào)節(jié)黑色素生成的作用及分子機(jī)制，有助于闡明甘草素誘導(dǎo)黑色素合成的作用機(jī)制，為治療色素沉著障礙提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高糖DMEM(11054001)、胰酶(15090046)、胎牛血清(12483020)購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；WB/IP 裂解液(P0013)、BCA 蛋白定量試劑盒(P0011)、ECL 發(fā)光液(P0018FS)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(A0208)和山羊抗鼠 IgG (A0216)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗 MITF 抗體(ab20663)、兔抗 TYR 抗體(ab180753)、鼠抗 β-actin 抗體(ab179467)購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；鼠抗 p-ERK抗體(sc-81492)、鼠抗 ERK 抗體(sc-514302)、鼠抗 p-p38抗體(sc-166182)、鼠抗 p38抗體(sc-398546)、鼠抗 p-JNK抗體(sc-6254)、鼠抗 JNK抗體(sc-7345)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；MTT試劑盒(BB-4201)購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；Masson-Fontana黑色素胺銀染色試劑盒(BP-DL371)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本 Sanyo 公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) BioTek公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

B16F10細(xì)胞在恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，傳代至3代以后，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，進(jìn)行給藥實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同劑量甘草素處理組(10，20，40，60，80 μmol/L)，給藥處理48 h后，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。為了進(jìn)一步探究甘草素影響黑色素合成的具體分子機(jī)制，選取40 μmol/L甘草素，處理時(shí)間分別為0，5，15，30，60，120 min。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

在B16F10細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞消化后種于96孔板中，每孔接種200 μL的細(xì)胞懸液(含10% 的FBS)，接種的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，靜置培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞貼壁后進(jìn)行給藥處理，吸出孔中上層液體，將含有不同濃度甘草素(0，10，20，40，60，80 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% 的FBS)換入96孔板中，每個(gè)濃度做4個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μL，然后繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。 按照V(DMEM)∶V(MTT)= 10∶1的比例，提前配制DMEM培養(yǎng)基與MTT的混合溶液，避光，然后吸出孔中上層液體，每孔加入110 μL的混合溶液，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中，孵育4 h。輕輕吸出上層液體，每孔加入150 μL的DMSO，然后放在搖床振搖10 min。將96孔板放入多功能酶標(biāo)儀中，570 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率[15]。

1.4 NaOH裂解法測(cè)定黑色素含量

在B16F10細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞消化后種于6孔板中，每孔接種2 mL的細(xì)胞懸液，接種的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，靜置培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞貼壁后進(jìn)行給藥處理，吸出孔中上層液體，將含有不同濃度待測(cè)藥物的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% 的FBS)換入6孔板中，每孔加入2 mL，繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。然后取出6孔板，用PBS洗2遍，冰上裂解20 min，刮下細(xì)胞，4 ℃離心15 min，吸凈上清蛋白，將下層的黑色素沉淀留在離心管中，然后向每個(gè)離心管中加入100 μL含10% DMSO 的NaOH 溶液，吹打混勻，然后放入80 ℃的金屬浴中，裂解2 h，取出渦旋混勻。將黑色素溶解液加入96孔板中，每孔加入100 μL，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，然后將96孔板放入多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)置波長(zhǎng)405 nm，測(cè)定每孔的吸光度值[16]。

1.5 Masson-Fontana黑色素胺銀染色

選擇10%甲醛水溶液作為固定液，將細(xì)胞提前接種到玻片上給藥處理，將做好的細(xì)胞爬片放入蒸餾水中，取出爬片加入Fontana 氨銀溶液，避光浸染12 h。蒸餾水沖洗5次，入海波溶液處理切片5 min，蒸餾水處理5 min，加入中性紅染色液，輕輕復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，選取95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水，最后用中性樹膠封固，進(jìn)行拍照觀察[17]。

1.6 Western blot 檢測(cè)黑色素相關(guān)蛋白表達(dá)

將給藥處理的細(xì)胞使用細(xì)胞裂解液裂解，收集上層的細(xì)胞蛋白，使用BCA測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，繪制的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品蛋白的濃度。每組樣品取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，按照雙層濾紙-膜-膠-雙層濾紙的順序組裝濾紙凝膠纖維素夾層，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后進(jìn)行封閉，加入稀釋的一抗進(jìn)行過(guò)夜孵育，回收一抗，用TBST清洗5次，孵育二抗，用TBST清洗5次，進(jìn)行顯影。將顯影所得的條帶通過(guò) Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量[18]。本組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究的數(shù)據(jù)均使用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并且采用 SPSS對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05 表明數(shù)據(jù)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù))。

2 結(jié) 果

2.1 甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞活力的影響

通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度的甘草素(0，10，20，40，60，80 μmol/L)對(duì)B16F10細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性。由圖1可見，與空白對(duì)照組相比，甘草素的濃度為10， 20，40，60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力沒(méi)有明顯受到影響，當(dāng)甘草素濃度為80 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的活力顯著下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。

圖1 甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of liquiritigenin on the viability of B16F10 cells

2.2 甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響

為研究甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞，加入同體積含不同濃度甘草素(0，10，20，40 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% FBS)，靜置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)48 h，NaOH裂解法測(cè)定不同濃度的甘草素(0，10，20，40 μmol/L)對(duì)B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響。由圖2可見，給藥48 h后，與空白組對(duì)照，給藥組的黑色素含量提高，說(shuō)明甘草素對(duì)黑色素合成起促進(jìn)作用，隨著給藥濃度的增大，影響黑色素合成越顯著，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖2 NaOH裂解法測(cè)定不同濃度甘草素對(duì)黑色素合成的影響Fig.2 Effect of different concentrations of liquiritigenin on melanin synthesis by NaOH pyrolysis method

通過(guò)Masson-Fontana黑色素胺銀染色方法觀察B16F10細(xì)胞的黑色素合成情況。由圖3可見，隨著甘草素濃度的增加，B16F10細(xì)胞中黑色素變多，與此同時(shí)，黑色素細(xì)胞樹突中的黑色素含量也明顯增多。

圖3 Masson-Fontana胺銀染色法測(cè)定不同濃度甘草素對(duì)黑色素合成的影響Fig.3 Effect of different concentrations of liquiritigenin on the synthesis of melanin by masson-fontana amine silver staining

2.3 甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞中黑色素合成相關(guān)蛋白TYR，TRP-1，TRP-2表達(dá)的影響

為了研究甘草素促進(jìn)黑色素合成的具體作用機(jī)制，采用免疫印跡法檢測(cè)甘草素對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白的影響。由圖4可見，不同濃度甘草素(0，10，20，40 μmol/L)處理B16F10細(xì)胞，酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP-1)表達(dá)顯著提高，酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP-2)表達(dá)沒(méi)有提高。另外，甘草素也能促進(jìn)MITF的表達(dá)。這些結(jié)果表明甘草素是通過(guò)上調(diào)黑色素合成相關(guān)蛋白TYR，TRP-1和MITF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)黑色素合成。

圖4 不同濃度甘草素對(duì)TYR，TRP-1，TRP-2， MITF蛋白水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of liquiritigenin on TYR, TRP-1, TRP-2 and MITF protein levels

2.4 甘草素對(duì)B16F10細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響

細(xì)胞中存在3條并行的MAPK通路，分別為p38，ERK和JNK。上述3條信號(hào)通路在調(diào)控黑色素合成方面都發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步闡明甘草素促進(jìn)黑色素合成的具體分子機(jī)制。選取40 μmol/L 甘草素，用不同時(shí)間(0，5，15，30，60，120 min)來(lái)處理細(xì)胞，觀察p38，ERK和JNK的激活情況。由圖5可見，甘草素可以激活p38通路，但是對(duì)ERK和JNK信號(hào)通路沒(méi)有影響。

2.5 p38通路抑制劑對(duì)甘草素促進(jìn)黑色素合成作用的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)p38通路對(duì)甘草素促進(jìn)黑色素合成作用的影響，在甘草素給藥之前，細(xì)胞用10 μmol/L SB203580(p38信號(hào)通路抑制劑)預(yù)處理1 h，之后加入甘草素處理細(xì)胞48 h，檢測(cè)黑色素含量。由圖6(柱1表示空白對(duì)照，柱2表示給予SB203580，柱3表示給予甘草素，柱4表示給予SB203580+甘草素)可見，p38信號(hào)通路抑制劑SB203580顯著抑制了甘草素的促黑色素合成作用。說(shuō)明甘草素通過(guò)激活p38信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)黑色素的合成。

圖6 甘草素對(duì)MAPK通路蛋白活性的影響Fig.6 Effect of liquiritigenin on MAPK pathway protein activity

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取甘草素作為藥物，研究甘草素促進(jìn)黑色素合成的作用及分子機(jī)制。研究結(jié)果表明：在細(xì)胞中加入不同濃度甘草素，細(xì)胞中黑色素含量明顯增多，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。Western-blot結(jié)果表明甘草素顯著促進(jìn)黑色素合成關(guān)鍵蛋白TYR的表達(dá)，MITF是促進(jìn)TYR表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果表明甘草素也可以顯著促進(jìn)MITF的表達(dá)。MITF的表達(dá)與其上游MAPK信號(hào)通路激活存在一定關(guān)聯(lián)，細(xì)胞中主要存在3條并行的MAPK通路，分別為p38，ERK和JNK。研究表明p38的激活可以上調(diào)MITF的表達(dá)，ERK的激活則可以促進(jìn)MITF的降解，JNK通路對(duì)MITF的影響依然存在爭(zhēng)議[19-20]。對(duì)給予甘草素處理之后細(xì)胞中的MAPK通路的激活情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甘草素只激活p38通路，對(duì)ERK和JNK通路沒(méi)有影響。在甘草素給藥之前，用SB203580(p38通路抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞1 h，發(fā)現(xiàn)可以抑制甘草素的促黑色素合成作用。以上研究結(jié)果表明：甘草素通過(guò)激活p38信號(hào)通路，促進(jìn)TYR，TRP-1和MITF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)黑色素合成。黑色素對(duì)于人體有著不可或缺的重要作用，它不僅可以預(yù)防紫外線并且還調(diào)節(jié)表皮內(nèi)環(huán)境，因此，此發(fā)現(xiàn)可能為保護(hù)人類免受紫外線引起的皮膚損傷提供一個(gè)潛在的候選化合物。