蘇亞勇，林 琳，陳小蘭，張惠勇，郭永木

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院感染科，福建 漳州 363000)

肝細(xì)胞癌具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高侵襲性的特征，在任何年齡段均可發(fā)病，尤其以50～70歲人群更常見，男性患病率高于女性[1]。該病早期無典型癥狀，多數(shù)患者在出現(xiàn)典型癥狀時才就診，而癌細(xì)胞已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后欠佳，盡早診斷與治療對降低肝細(xì)胞癌的病死率至關(guān)重要。既往實(shí)驗(yàn)室檢查提示，肝細(xì)胞癌患者伴有癌抗原125、癌胚抗原、糖類抗原199等水平增高，但這些腫瘤標(biāo)記物缺乏特異性，在其他疾病(如酒精性肝病、膽管炎等)中也可見增高[2]。因此，臨床仍需尋求更理想的指標(biāo)。近年來，有研究指出微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而發(fā)揮抑癌或者促癌作用[3]。趙輝明等[4]發(fā)現(xiàn)喉鱗癌組織中miR-155呈高表達(dá)。牛連杰等[5]的研究顯示乙肝病毒X蛋白能對miR-155進(jìn)行調(diào)控，從而參與肝細(xì)胞癌惡性轉(zhuǎn)化過程。這提示miR-155與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但其對肝細(xì)胞癌遠(yuǎn)期預(yù)后的影響尚未完全明確。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可通過募集轉(zhuǎn)錄因子對鄰近蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，或者靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤的進(jìn)展，與患者預(yù)后密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(zinc finger protein，ZNF)在乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且對預(yù)后評估有一定價值[7-8]。ZNF385D-AS2作為ZNF中的一員，可能也參與了腫瘤進(jìn)展，但其與肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系尚不明確，需要臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。基于此，本研究擬分析肝細(xì)胞癌中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2、miR-155預(yù)測預(yù)后的價值，以期為改善肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后提供思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5月至2019年5月我院收治的肝細(xì)胞癌患者156例，其中男89例，女67例；年齡38～72歲，平均(58.42±10.76)歲；腫瘤直徑：>5 cm 72例，≤5 cm 84例；肝硬化：有43例，無113例；Child-Pugh分級：A級82例，B級74例；靜脈浸潤：有40例，無116例；腫瘤數(shù)目：單發(fā)71例，多發(fā)85例；分化程度：低分化53例，中/高分化103例；臨床分期：Ⅰ期43例，Ⅱ期51例，Ⅲ期62例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷證實(shí)為肝細(xì)胞癌；年齡≥18歲；術(shù)前無新輔助放療、化療史；首次確診為肝細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：有肝細(xì)胞癌切除禁忌證；合并嚴(yán)重的心血管、腦血管疾病，危及患者生命；合并其他類型的原發(fā)性腫瘤；長期使用免疫抑制劑、激素等藥物；合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾?。怀霈F(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究方案獲我院倫理委員會批準(zhǔn)(2017027)，患者對手術(shù)知情同意并自愿簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有患者均通過手術(shù)取肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織(距離肝細(xì)胞癌病灶至少3 cm)，檢測組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表達(dá)水平，在收集組織標(biāo)本時避開壞死、出血組織，待標(biāo)本離體后快速置于液氮內(nèi)，然后存放至-80 ℃環(huán)境下。采用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)檢測，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑、氯仿、Taq DNA聚合酶、異丙醇、異戊醇均購自上海賽默飛世爾科技有限公司；主要儀器包括紫外分光光度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司，N2型)、高速冷凍機(jī)(武漢提沃克科技有限公司，DW-40FL262型)、離心機(jī)(山東博科控股集團(tuán)有限公司，TGL-16M型)、超低溫冰箱(山東博科控股集團(tuán)有限公司，BDF-86V348型)、恒溫箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司，F(xiàn)YL-YS-150L型)、熒光定量PCR儀(蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司，MA-6000型)。

提取組織總RNA：取組織樣本約0.1 g置于冷凍研缽內(nèi)，加入液氮研磨成細(xì)粉，將樣本置于離心管內(nèi)，加入1 mL TRIzol試劑反復(fù)吹打，使樣本無黏稠感。在室溫下放置15 min，加入200 μL氯仿震蕩30 s充分混合，靜置5 min。在4 ℃下離心15 min(12 000 r/min)，將上清液移至無RNA酶EP管內(nèi)，加入500 μL異丙醇充分混合，室溫下反應(yīng)10 min，在4 ℃下離心10 min(12 000 r/min)。棄上清液，加入1 mL 75%乙醇輕輕吹打，在4 ℃下離心5 min(7 500 r/min)。棄上清液，倒置行干燥處理5 min。加入20 μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定RNA純度、濃度，存放至-20 ℃下備用。

逆轉(zhuǎn)錄與PCR檢測：利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增，經(jīng)熒光定量PCR儀測定目的基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)，95 ℃ 5 s(變性)，60 ℃ 35 s(退火、延伸)，40個循環(huán)。ZNF385D-AS2上、下游序列分別為5’-GGTCTCGGTACATGCGTGGA-3’、5’-TGGCAGTATAACAGGCTCCC-3’。miR-155上、下游序列分別為5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’、5’-CCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3’。GAPDH上、下游序列分別為5’-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’、5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’。以2-ΔΔCT計(jì)算lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155相對表達(dá)量。

1.3 隨訪

患者術(shù)后隨訪24個月，每隔3個月通過微信、電話等隨訪1次，在隨訪期間，患者根據(jù)醫(yī)囑入院復(fù)查，觀察腫瘤有無復(fù)發(fā)，記錄隨訪期間患者的無瘤生存率與累積生存率。記錄患者術(shù)后24個月的生存情況，根據(jù)lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表達(dá)情況分成高表達(dá)組與低表達(dá)組，并分析二者與臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表達(dá)比較

肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.001)，miR-155表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.001)，見表1。經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析顯示，肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.711，P<0.001)。

表1 肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表達(dá)比較

2.2 肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2表達(dá)均值分組，將其表達(dá)水平≥0.25者納入高表達(dá)組，表達(dá)水平<0.25者納入低表達(dá)組。lncRNA ZNF385D-AS2低表達(dá)組靜脈浸潤占比(χ2=12.178，P<0.001)、多發(fā)性腫瘤占比(χ2=7.634，P=0.006)、低分化占比(χ2=19.868，P<0.001)、臨床分期Ⅲ期占比(χ2=9.756，P=0.008)高于lncRNA ZNF385D-AS2高表達(dá)組，見表2。

表2 肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 肝細(xì)胞癌組織中miR-155表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)肝細(xì)胞癌組織中miR-155表達(dá)均值分組，將其表達(dá)水平≥8.93者納入高表達(dá)組，表達(dá)水平<8.93者納入低表達(dá)組。miR-155高表達(dá)組靜脈浸潤占比(χ2=12.804，P<0.001)、多發(fā)性腫瘤占比(χ2=11.766，P=0.001)、低分化占比(χ2=6.417，P=0.011)、臨床分期Ⅲ期占比(χ2=11.400，P=0.003)高于miR-155低表達(dá)組，見表3。

表3 肝細(xì)胞癌組織中miR-155表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155對肝細(xì)胞癌預(yù)后的評估價值

lncRNA ZNF385D-AS2高表達(dá)組無瘤生存率為90.00%(72/80)，高于lncRNA ZNF385D-AS2低表達(dá)組的71.05%(54/76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=9.008，P=0.009);lncRNA ZNF385D-AS2高表達(dá)組累積生存率為92.50%(74/80)，高于lncRNA ZNF385D-AS2低表達(dá)組的76.32%(58/76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=7.842，P=0.018)，見圖1。miR-155高表達(dá)組無瘤生存率為73.56%(64/87)，低于miR-155低表達(dá)組的89.86%(62/69)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=6.576，P=0.020)；miR-155高表達(dá)組累積生存率為77.01%(67/87)，低于miR-155低表達(dá)組的94.20%(65/69)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=8.736，P=0.010)，見圖2。

a：無瘤生存曲線；b：累積生存曲線圖1 不同lncRNA ZNF385D-AS2表達(dá)患者的無瘤生存曲線和累積生存曲線

a：無瘤生存曲線；b：累積生存曲線圖2 不同miR-155表達(dá)患者的無瘤生存曲線和累積生存曲線

3 討論

肝細(xì)胞癌在全球患病率較高，每年新增病例高達(dá)74萬人，發(fā)病率呈逐年增高趨勢[9]。我國每年約有11萬人因肝細(xì)胞癌死亡，尤其對晚期患者而言，平均生存期僅6個月，未采取任何治療措施者5年生存率低于3%[10]。目前，外科手術(shù)以及放療、化療等綜合治療的應(yīng)用使肝細(xì)胞癌的病死率有所下降，但該病復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高，易導(dǎo)致預(yù)后不良[11]。因此，臨床急需尋求預(yù)測預(yù)后的理想指標(biāo)，以便及時預(yù)測預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，采取措施降低病死率。

非編碼RNA包括lncRNA和miRNA，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用近年來備受關(guān)注[12]。lncRNA是長度大于200個核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄子，在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮作用。lncRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，與癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)行為有關(guān)[6]。lncRNA與miRNA的相互調(diào)控關(guān)系在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色。lncRNA可以靶向作用于miRNA，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤組織中的差異表達(dá)對患者預(yù)后評估有較高價值[6,13]。

有研究發(fā)現(xiàn),ZNF在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，在宮頸癌、膠質(zhì)瘤中均可見異常表達(dá)，其可能通過調(diào)節(jié)核因子κB1信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這可能是其抑制惡性腫瘤進(jìn)展的一種機(jī)制[14]。ZNF385D-AS2是ZNF的家族成員之一，在腫瘤中的作用報(bào)道甚少。miR-155與免疫炎癥密切相關(guān)，可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)信號通路，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[15]。在肝細(xì)胞癌中，miR-155起到癌基因作用，可能通過SPRK1信號通路[16]、ATG5信號通路[17]等促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。在前期我們用分子生物學(xué)信息軟件預(yù)測到miR-155與ZNF385D-AS2有結(jié)合位點(diǎn)，提示ZNF385D-AS2可能通過miR-155參與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。本研究檢測了ZNF385D-AS2和miR-155在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示ZNF385D-AS2表達(dá)下調(diào)，miR-155表達(dá)上調(diào)；Pearson線性相關(guān)分析顯示，ZNF385D-AS2與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能存在負(fù)調(diào)控作用。本研究結(jié)果還顯示，ZNF385D-AS2、miR-155表達(dá)均與靜脈浸潤、腫瘤數(shù)目、分化程度、臨床分期有關(guān)。伴有靜脈浸潤、腫瘤數(shù)目多、分化程度低以及臨床分期高的患者腫瘤惡變程度高，更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，在這個過程中可能有ZNF385D-AS2、miR-155參與，ZNF385D-AS2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用減弱，而miR-155表達(dá)上調(diào)則能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，二者共同作用導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲是影響腫瘤預(yù)后的重要因素[12]，我們推測ZNF385D-AS2和miR-155與肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ZNF385D-AS2高表達(dá)及miR-155低表達(dá)患者的無瘤生存率、累積生存率更高，提示二者可能對預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后有一定價值。有學(xué)者對肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ZNF385D-AS2在肝細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平越低，患者的生存率越低[18]，本研究結(jié)果與之一致。本研究發(fā)現(xiàn)miR-155高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)，結(jié)合既往已有研究發(fā)現(xiàn)miR-155高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[19]，提示miR-155在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可能成為肝癌的治療靶點(diǎn)之一。

綜上所述，肝細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA ZNF385D-AS2呈低表達(dá)，miR-155呈高表達(dá)，二者表達(dá)可能與靜脈浸潤、腫瘤數(shù)目、分化程度、臨床分期相關(guān)，且對預(yù)后有一定預(yù)測價值。本研究局限性為miR-155、lncRNA ZNF385D-AS2作用于肝細(xì)胞癌的靶基因尚未完全明確，這也是臨床研究的一大難點(diǎn)，日后還有待對此進(jìn)行更深入研究。