何 曦，李 釗，張建輝，郭 欣，楊怡靜

(成都市第三人民醫(yī)院，四川 成都 610031)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)為常見(jiàn)惡性腫瘤，有獨(dú)特流行病學(xué)特點(diǎn)，好發(fā)于中老年人，發(fā)病率位居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首，與遺傳因素、環(huán)境因素、病毒感染等有關(guān)，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1-2].

放療是治療NPC患者的首選方法，可明顯控制病情，研究[3]發(fā)現(xiàn)：NPC放療后仍存在部分瘤灶殘留或復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)診斷直接影響著下一步治療方案和患者預(yù)后.NPC化療后患者頸部將出現(xiàn)不同程度纖維化，CT或MRI影像學(xué)檢查不利于患者早期診治，目前生物學(xué)標(biāo)志物在腫瘤診療中發(fā)揮重要作用[4].微小核糖核酸(micro RNA，miRNA)是一類數(shù)量多、功能雜的調(diào)控因子，miR-10b屬于miRNA成員之一，在惡性腫瘤中常見(jiàn)[5].有研究[6]發(fā)現(xiàn)：miR-10b表達(dá)與其上游調(diào)節(jié)因子EB病毒編碼潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)/人Twist相關(guān)蛋白1(Human twist related protein 1，Twist1)間存在密切關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)NPC在惡性腫瘤中通過(guò)LMP1/Twist1調(diào)控miR-10b表達(dá)而參與疾病發(fā)生和發(fā)展.還有研究[7]發(fā)現(xiàn)：LMP1可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞永生化，惡性轉(zhuǎn)化鼠成纖維細(xì)胞及人上皮細(xì)胞，影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡.Twist1過(guò)高表達(dá)與乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[8].本研究通過(guò)探究血清中miR-10b、LMP1和Twist1聯(lián)合檢測(cè)在NPC早期診斷及復(fù)發(fā)診斷中的應(yīng)用價(jià)值，旨在為NPC診治和預(yù)后評(píng)估提供更多參考.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2020年1月成都市第三人民醫(yī)院收治的NPC患者113例(NPC組)、鼻咽炎45例患者(鼻咽炎組)為研究對(duì)象.其中，NPC組患者男61例，女52例，年齡32～60歲，平均(45.34±10.27)歲，臨床分期：Ⅰ期54例、Ⅱ期59例；鼻咽炎組患者男25例，女20例，年齡31～61歲，平均(44.97±9.99)歲.兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具備可比性.

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理活檢(病灶呈結(jié)節(jié)狀、菜花狀，局部粗糙隆起)明確診斷為NPC或鼻咽炎；抽取血液前未接受任何治療；NPC患者無(wú)放療禁忌證；鼻咽炎患者既往無(wú)鼻咽部腫瘤.

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類型腫瘤者；NPC患者KPS評(píng)分低于60分者；近期存在嚴(yán)重感染者；合并重要臟器功能障礙者；存在風(fēng)濕免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾病者；對(duì)放療不耐受(放療期間發(fā)生嚴(yán)重放療并發(fā)癥)者；生物制劑過(guò)敏者；合并嚴(yán)重精神疾病者.

1.2 研究方法

血清中miR-10b、LMP1和Twist1檢測(cè)：采集入組患者治療前晨起空腹外周血3 mL，放置于EP管內(nèi)，室溫下靜置30 min，待自然凝固后常規(guī)離心(1 000 r/min，離心半徑為9 cm)10 min后，收集血清(上清液)，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè).應(yīng)用快速mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將已純化好的總mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并采用熒光定量PCR試劑盒在ABI 7500儀器上行qPCR反應(yīng)，以檢測(cè)血清中miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后取平均值.并根據(jù)LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)水平將NPC患者分為Twist1陰性表達(dá)組、Twist1陰性而LMP1陽(yáng)性表達(dá)組、Twist1、LMP1同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)組.

NPC患者治療方法：患者均給予放療，放療前應(yīng)用多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶或紫杉醇+順鉑等方案化療；對(duì)鼻咽部和頸部淋巴結(jié)進(jìn)行放射線(調(diào)強(qiáng)適形放射治療(IMRT))治療，放療劑量為50～70 Gy；采用西妥昔單抗或尼妥珠單抗進(jìn)行靶向治療.

NPC患者復(fù)發(fā)隨訪情況：療程結(jié)束后隨訪18個(gè)月.復(fù)發(fā)判斷[9]標(biāo)準(zhǔn)：NPC患者放療后經(jīng)影像學(xué)檢查存在瘤灶殘留，經(jīng)細(xì)胞學(xué)穿刺學(xué)檢查、手術(shù)切除后病理和臨床+多種影像學(xué)檢查明確診斷為瘤灶復(fù)發(fā)，并依據(jù)NPC患者有無(wú)復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 NPC組、鼻咽炎組血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)

本研究結(jié)果顯示：NPC組血清miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量明顯高于鼻咽炎組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見(jiàn)表1.

表1 NPC組、鼻咽炎組血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)Tab.1 Serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression in NPC group and nasopharyngitis group

2.2 miR-10b表達(dá)水平與Twist1、LMP1關(guān)系

本研究結(jié)果顯示：Twist1陰性表達(dá)組、Twist1陰性及LMP1陽(yáng)性表達(dá)組、Twist1、LMP1同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)組miR-10b表達(dá)水平依次明顯增高(P<0.05).見(jiàn)表2.

表2 NPC患者miR-10b表達(dá)水平與Twist1、LMP1關(guān)系Tab.2 Relationship between miR-10b expression level and Twist1 and LMP1 in NPC patients

2.3 血清miR-10b、LMP1和Twist1預(yù)測(cè)NPC的ROC曲線分析

本研究結(jié)果顯示：血清miR-10b、LMP1和Twist1三項(xiàng)聯(lián)合(串聯(lián))檢測(cè)預(yù)測(cè)NPC的價(jià)值較高(特異度、ROC曲線下面積分別為86.5%、0.860)，高于三者單獨(dú)檢測(cè)，而血清miR-10b預(yù)測(cè)NPC的ROC曲線下面積、特異度高于LMP1、Twist1.見(jiàn)圖1、表3.

圖1血清miR-10b、LMP1和Twist1預(yù)測(cè)NPC的ROC曲線Fig.1ROC curve of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 predicting NPC

表3 血清miR-10b、LMP1和Twist1預(yù)測(cè)NPC的ROC曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 predicting NPC

2.4 NPC患者復(fù)發(fā)的單因素分析

本研究結(jié)果顯示：NPC患者113例，復(fù)發(fā)19例，復(fù)發(fā)率為16.81%；復(fù)發(fā)組患者年齡≥30歲、分化程度為低分化、血清miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)組(P<0.05).見(jiàn)表4.

表4 影響NPC患者復(fù)發(fā)的單因素分析Tab.4 Single factor analysis of affecting recurrence in NPC patients

2.5 影響NPC患者復(fù)發(fā)的混雜因素Logistics回歸分析

NPC患者是否復(fù)發(fā)為應(yīng)變量(復(fù)發(fā)=1、無(wú)復(fù)發(fā)=0)，上述單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)(年齡：≥30歲=1、<30歲=0；分化程度：低分化=1、高分化或中分化=0；血清miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量以實(shí)際值為準(zhǔn))為自變量進(jìn)行賦值，經(jīng)Logistics回歸方程分析并校正混雜因素(年齡、分化程度)后，提示血清miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量是NPC患者復(fù)發(fā)的影響因素(P<0.05).見(jiàn)表5.

表5 影響NPC患者復(fù)發(fā)的混雜因素Logistics回歸分析Tab.5 Logistics regression analysis of confounding factors affecting recurrence of NPC patients

2.6 血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)預(yù)測(cè)NPC復(fù)發(fā)的ROC曲線分析

本研究結(jié)果顯示：血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)聯(lián)合(串聯(lián))檢測(cè)預(yù)測(cè)NPC患者復(fù)發(fā)的特異度(89.9%)和ROC曲線下面積(0.892)高于單一檢測(cè).見(jiàn)表6和圖2.

表6 血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)預(yù)測(cè)NPC復(fù)發(fā)的ROC曲線分析Tab.6 ROC curve analysis of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression in predicting NPC recurrence

圖2血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)預(yù)測(cè)NPC復(fù)發(fā)的ROC曲線Fig.2ROC curve of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression predicting NPC recurrence

3 討 論

NPC是鼻咽黏膜的惡性腫瘤，有早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部侵襲特征，轉(zhuǎn)移患者預(yù)后差且復(fù)發(fā)率高[10].MRI和CT等影像學(xué)技術(shù)盡管在惡性腫瘤輔助診治中發(fā)揮重要作用，但對(duì)于早期NPC患者診斷的特異度和靈敏度并不高，目前大量研究[11]證實(shí)血清學(xué)標(biāo)志物在惡性腫瘤早期預(yù)測(cè)中有積極作用.劉春麗等[12]報(bào)道NPC患者癌組織中miR-10b表達(dá)明顯增高，且其表達(dá)水平與患者年齡、臨床分期等緊密相關(guān).孟大為等[13]研究發(fā)現(xiàn)，降低Twist1表達(dá)可增加NPC細(xì)胞對(duì)化療藥物紫杉醇的敏感性，并推測(cè)Twist1蛋白可作為一項(xiàng)新的NPC治療靶標(biāo).YE Q等[14]展開(kāi)的LMP1和Cripto-1在鼻咽癌中共表達(dá)的體內(nèi)外研究中證實(shí)，NPC組織中LMP1表達(dá)水平明顯高于鼻咽炎的表達(dá)水平，其水平高低與NPC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān).現(xiàn)階段關(guān)于miR-10b、LMP1和Twist1與NPC關(guān)系研究停留在動(dòng)物、組織學(xué)層面，血清屬于理想的介質(zhì)，取材方便且創(chuàng)傷小，近年來(lái)隨著芯片PCR技術(shù)日益完善，進(jìn)一步明確血清中miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)在NPC患者早期診斷和復(fù)發(fā)診斷中的應(yīng)用價(jià)值具備可行性和臨床指導(dǎo)價(jià)值.

本研究結(jié)果顯示，NPC組血清miR-10b、LMP1、Twist1相對(duì)表達(dá)量較鼻咽炎組高，不同于其他研究之處：本研究檢測(cè)的為血清學(xué)標(biāo)志物，提示NPC患者血清miR-10b、LMP1、Twist1表達(dá)異常增高，說(shuō)明異常增高的血清miR-10b、LMP1和Twist1可能相互協(xié)同參與NPC疾病的發(fā)生和發(fā)展.李偉利等[15]在血清miR-20a等指標(biāo)表達(dá)對(duì)早期NPC的診斷價(jià)值研究中，通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血清學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可準(zhǔn)確、特異性地預(yù)測(cè)早期NPC.而本研究結(jié)果顯示：血清miR-10b、LMP1和Twist1三項(xiàng)聯(lián)合(臨界值分別為2.31、1.92、1.87)檢測(cè)診斷NPC的特異度、ROC曲線下面積分別為86.5%、0.860，高于三者單獨(dú)檢測(cè)，其中，血清miR-10b預(yù)測(cè)NPC的ROC曲線下面積、靈敏度高于LMP1、Twist1，提示血清miR-10b≥2.31、LMP1≥1.92和Twist1≥1.87時(shí)鼻咽部疾病患者可明確診斷為早期NPC，積極監(jiān)測(cè)患者血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)水平可有效提高NPC的早期診斷率.復(fù)發(fā)是危害NPC患者生存的重要影響因素[16-17]，本研究納入NPC患者臨床分期以Ⅰ期、Ⅱ期為主，且隨訪時(shí)間短，NPC患者復(fù)發(fā)率為16.81%，但短期內(nèi)復(fù)發(fā)率仍較高的原因考慮可能是本次應(yīng)用化療藥物量低.因此，早期預(yù)測(cè)患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)對(duì)及時(shí)有效治療和降低死亡率、提高生命質(zhì)量有積極意義.

本次研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組患者年齡≥30歲、分化程度為低分化、血清miR-10b、LMP1和Twist1相對(duì)表達(dá)量較無(wú)復(fù)發(fā)組明顯高，進(jìn)一步校正混雜因素結(jié)果顯示：血清miR-10b(OR=1.523，95%CI：1.216～1.909)、LMP1(OR=1.523，95%CI：1.029～2.142)和Twist1相對(duì)表達(dá)量(OR=1.523，95%CI：1.052～2.189)與NPC患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)，提示血清中miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)可能參與NPC患者腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增加患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn).miR-10b在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化調(diào)控及凋亡中起著重要作用，有研究[18-19]證實(shí)miR-10b參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)高miR-10b水平，可通過(guò)特異性調(diào)節(jié)多種靶基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，也佐證了miR-10b是NPC患者復(fù)發(fā)的高危因素.HUO H等[20]研究表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的LMP1基因敲除可明顯抑制Eb病毒感染及NPC細(xì)胞生長(zhǎng)，由此推測(cè)血清LMP1表達(dá)水平與NPC患者復(fù)發(fā)有關(guān).Twist1可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞/間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，在胚胎發(fā)育期可影響細(xì)胞遷移[21-23].有研究[24-25]指出，Twist1在多類癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，Twist1過(guò)表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞凋亡，因此，推測(cè)血清Twist1表達(dá)參與NPC患者的復(fù)發(fā).此外，本研究結(jié)果顯示：血清miR-10b、LMP1和Twist1表達(dá)聯(lián)合(串聯(lián))檢測(cè)預(yù)測(cè)NPC患者復(fù)發(fā)的特異度(89.9%)、ROC曲線下面積(0.892)較三者單一檢測(cè)的要高，提示血清miR-10b、LMP1和Twist1聯(lián)合檢測(cè)可特異性的預(yù)測(cè)NPC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn).因此，臨床上通過(guò)加強(qiáng)NPC患者血清miR-10b、LMP1和Twist1的監(jiān)測(cè)是十分必要的，對(duì)早期防治具有重要指導(dǎo)意義.

綜上所述，本研究初步證實(shí)血清中miR-10b、LMP1和Twist1聯(lián)合檢測(cè)在NPC早期診斷及復(fù)發(fā)診斷中有明確應(yīng)用價(jià)值，對(duì)指導(dǎo)NPC患者早期防治和改善預(yù)后具有積極臨床意義.但本研究尚未明確三者參與NPC復(fù)發(fā)的具體分子信號(hào)通路，未來(lái)還需進(jìn)一步研究完善.