傅厚道，費(fèi)明明,2，金 彤,2，胡 蔚,陳雪慧，余 靜，張 順,2

(1中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院·浙江 寧波 315000；2浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·浙江 寧波 315000)

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其死亡率位居所有癌癥之首[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的80%～85%[2]。早期篩查的普及、手術(shù)與放化療技術(shù)的進(jìn)步以及靶向治療藥物的相繼問世，提高了NSCLC的總體生存期，但對(duì)于失去了治愈機(jī)會(huì)的晚期NSCLC患者，其5年總生存率只有6%[3-5]。中醫(yī)藥在晚期NSCLC治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠增強(qiáng)體能，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)總生存期，減少各種不良反應(yīng)[6]。紅藍(lán)方(Honglan Decoction，HLD)是浙江省名中醫(yī)沈力基于腫瘤患者正虛邪實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)[7]，以解毒攻邪、扶正抗癌為法創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，在減少放化療副反應(yīng)、提高生存質(zhì)量、延緩疾病進(jìn)展等方面獲得了較好療效，并使部分晚期患者能長(zhǎng)期帶瘤生存[8]。本課題以人肺癌A549細(xì)胞系作為研究模型，觀察HLD體外對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，并檢測(cè)相關(guān)調(diào)控通路的因子變化，進(jìn)而探討HLD治療NSCLC的可能分子生物學(xué)機(jī)制，為進(jìn)一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，SCSP-503。

紅藍(lán)方(HLD)：自制，水煎法制備，南方紅豆杉、絞股藍(lán)、浙貝母、白花蛇舌草、藤梨根、半枝蓮、枸杞子及杜仲等均組方藥味購(gòu)自寧波明貝中藥業(yè)有限公司。F12培養(yǎng)基：Hyclone，SH30026.01B；胎牛血清：Gibco，10099-141；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，70-CCS012；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：BD，550911；BCA蛋白定量試劑盒：ThermoFisher，3227；CCK-8試劑盒：索萊寶，CA1210；活性氧檢測(cè)試劑盒：索萊寶，CA1410；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒：索萊寶，M8650；HRP-標(biāo)記山羊抗兔：碧云天，A0208；所有抗體均購(gòu)自CST公司：PAPR(5625)、Bcl-2(4223)、Mcl-1(94296)、P-Mcl-1(14765)、Bim(2993)、Bax(5023)、Bok(86875)、Noxa(14766)、β-actin(4970)。

1.2 儀器 RV 10 auto pro V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA；SpectraMax M5酶標(biāo)儀：Molecular Devices；Axio Vert.A1熒光顯微鏡：Zeiss；蛋白質(zhì)電泳儀：Bio-Rad；Allegra X-12R離心機(jī)：Beckman。

1.3 方法

1.3.1 紅藍(lán)方水提液制備 紅藍(lán)方(HLD)：取南方紅豆杉6 g，絞股藍(lán)9 g，白花蛇舌草15 g，藤梨根15 g，半枝蓮15 g，山楂10 g。置于醫(yī)用不銹鋼鍋，浸泡過夜，加8 倍水煮沸30 min，倒出藥液，后加8 倍水煮沸20 min，再加5倍水煮沸20 min，將3 次藥液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上80 ℃水浴中濃縮成約40 mL藥液，入真空干燥箱中干燥，得浸膏6 g，按100%濃度計(jì)算得率。取1 g紅藍(lán)方水提液浸膏，其中加入10 mL超純水，37 ℃水浴10 min，并于旋渦混合儀上混合助溶，充分溶解后，經(jīng)高速離心機(jī)1 200 r/min離心15 min，取上清液，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌，制成母液濃度100 g/L，置-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 細(xì)胞活力和增殖能力檢測(cè) CCK-8法。細(xì)胞5 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中，設(shè)空白對(duì)照組、HLD組，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，HLD組按不同濃度加入(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。不同作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞1 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中。設(shè)空白對(duì)照組、HLD組，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，HLD組加入不同濃度方藥(1、2、4 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.3 細(xì)胞凋亡和周期的檢測(cè) 細(xì)胞傳代后貼壁過夜，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、HLD組(1、2、4 g/L)，藥物處理24 h后，收集培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞以及貼壁的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取1×106個(gè)細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide混勻，對(duì)照組加入PBS，室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞周期檢測(cè)：取1×106個(gè)細(xì)胞，加入1 mL DNA staining solution和10 μL Permeabilization solution，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) A549細(xì)胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除舊培養(yǎng)基，加入使用無血清培養(yǎng)基1∶1 000稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，加入完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。并用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.3.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 細(xì)胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除舊培養(yǎng)基。使用超純水和JC-1染色緩沖液配制JC-1染色工作液。加入1 mL完全培養(yǎng)基，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，37 ℃孵育20 min。用超純水和JC-1染色緩沖液配制洗滌液，冰浴。孵育結(jié)束后，使用洗滌液洗滌2次，加入2 mL完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察并拍照，并用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.3.6 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) Western Blot檢測(cè)。細(xì)胞用HLD(1、2、4 g/L)處理24 h，去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌1 次，迅速加入蛋白裂解液，冰上放置20 min后超聲處理并提取總蛋白。所得蛋白樣品使用Western-blot檢測(cè)蛋白(PARP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Mcl-1、p-Mcl-1、BimEL、BimL、Bok、Noxa、β-actin)表達(dá)情況。曝光后的條帶使用image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 HLD對(duì)A549細(xì)胞活力和增殖能力的影響 以不同濃度HLD處理24 h后，A549細(xì)胞活力隨著HLD濃度的增高而下降，IC50為4.8 g/L，見圖1A。以1、2、4 g/L的HLD處理6、12、24、48 h后，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的HLD均抑制A549細(xì)胞增殖(P<0.001)，且抑制作用隨濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。HLD能以時(shí)間和濃度依賴性的方式抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，見圖1 B。

圖1 各組A549細(xì)胞增殖的CCK-8檢測(cè)結(jié)果

2.2 HLD對(duì)A549細(xì)胞周期與凋亡的影響 不同濃度HLD處理A549細(xì)胞24 h，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加，說明HLD能將A549細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；與空白對(duì)照組相比，不同濃度HLD均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，且具有濃度依賴性。見圖2與表1。

表1 各組A549細(xì)胞周期占比及凋亡率比較

2.3 HLD對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響 熒光探針DCFH-DA本身不帶熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被脂酶水解成DCFH后不能穿透細(xì)胞膜。且DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化成有熒光的DCF，因此DCF的亮度代表細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，見圖3和表2。從圖3可見，隨著HLD濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光上升，表明細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的上升，說明HLD能夠上調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

圖3 HLD對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

表2 各組A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平熒光強(qiáng)度比較

2.4 HLD對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響 JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位ΔΨm的熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，為JC-1單體，產(chǎn)生綠色熒光。使用紅綠熒光的相對(duì)比例能夠衡量線粒體去極化的比例，且線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件，見圖4和表3。從圖5可見，隨著HLD處理濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)紅綠熒光比例下降明顯，表明HLD能夠使細(xì)胞線粒體膜電位下降。

圖4 HLD對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

表3 各組A549細(xì)胞內(nèi)JC-1熒光強(qiáng)度比較

2.5 HLD對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控作用 圖5可知，與空白對(duì)照組相比，不同濃度HLD組的凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白均增加。線粒體途徑促凋亡蛋白BimL、Bax、Bok、Noxa升高，抗凋亡蛋白Bcl-2與磷酸化的Mcl-1水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肺癌可歸屬于中醫(yī)“癥瘕”“積聚”范疇，基本病機(jī)為正虛邪實(shí)，以痰濕瘀毒為病理因素，以正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)[9-10]。臨證時(shí)雖因素體稟賦的差異和陰陽(yáng)盛衰的偏頗導(dǎo)致具體的證候有所不同，但是在治療上仍要以補(bǔ)虛扶正和解毒抗癌兼顧為要。沈力主任醫(yī)師臨證五十載，學(xué)驗(yàn)俱豐，其創(chuàng)立的紅藍(lán)方在增強(qiáng)放化療療效并減少毒副反應(yīng)，預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延緩疾病進(jìn)展延長(zhǎng)生存期等方面都取得了良好的療效。紅藍(lán)方中紅豆杉祛邪散結(jié)，絞股藍(lán)益氣補(bǔ)虛解毒，浙貝母、蛇舌草、藤梨根、半枝蓮清熱解毒，枸杞子、杜仲扶正固本，全方共奏扶正補(bǔ)虛益氣、解毒攻邪抗癌之效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，紅豆杉水提物能促進(jìn)肺癌細(xì)胞caspase-9/8/3及PARP的切割進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞和組織影響很小[11]。絞股藍(lán)所含皂甙可以誘導(dǎo)體內(nèi)外NSCLC細(xì)胞凋亡，還能調(diào)節(jié)免疫[12-13]。蛇舌草及半枝蓮等藥物也在體內(nèi)外顯示出良好的抗腫瘤作用[14-15]。

對(duì)細(xì)胞死亡研究的深入發(fā)現(xiàn)了新的程序性死亡形式，包括自噬性死亡、鐵死亡、焦亡等，但目前的腫瘤臨床治療中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡仍然是治療起效的最主要機(jī)制[16]。線粒體途徑的凋亡由Bcl-2家族進(jìn)行調(diào)控，后者分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類。BimL、Bax、Bok、Noxa等屬于促凋亡蛋白，通過增加線粒體膜的通透性引發(fā)線粒體膜電位改變，并使細(xì)胞色素C和ROS從線粒體釋放，激活Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終切割并活化“凋亡執(zhí)行者”Caspase-3，對(duì)PARP等維持細(xì)胞存活的蛋白進(jìn)行水解，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡的不可逆階段，而Bcl-2與Mcl-1屬于抗凋亡蛋白，通過拮抗促凋亡蛋白的功能，防止凋亡的發(fā)生。

本文結(jié)果顯示，經(jīng)HLD處理后A549細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加，ROS水平上升，線粒體途徑促凋亡因子BimL、Bax、Bok、Nox上調(diào)，抗凋亡因子Bcl-2與P-Mcl-1下調(diào)，Caspase-3和PARP-1切割增加；表明HLD通過線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上，紅藍(lán)方以濃度和時(shí)間依賴的方式通過線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，本文結(jié)果為紅藍(lán)方進(jìn)一步的臨床和基礎(chǔ)研究提供基礎(chǔ)。