李超然，王 雪，馮楚文，楊 燕，孫忠人，王玉琳，屈媛媛，王慶勇，孫維伯，楊添淞

(1浙江中醫(yī)藥大學·浙江 杭州 310000；2黑龍江中醫(yī)藥大學·黑龍江 哈爾濱 150040；3重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院·重慶 4012202；4哈爾濱醫(yī)科大學·黑龍江 哈爾濱 150086)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種以長期(超過6個月)且嚴重的疲勞為主癥的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，伴隨有胃腸道癥狀(腹痛、腹瀉和/或便秘)[1]。研究指出CFS的發(fā)生可能繼發(fā)于胃腸道感染，事實上，CFS與腸易激綜合征或者克羅恩病常合并出現(xiàn)[2]。CFS患者腸道菌群失調(diào)，可能伴隨有腸道炎癥反應，腸黏膜屏障功能受損，導致腸道“易怒”[3-4]；通過作用于腸道的感覺、運動和免疫系統(tǒng)，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)本病[4]。緊密連接蛋白包括閉合蛋白(Occludin)和閉鎖連接蛋白(Zonula occludens，ZOs)等，是保護腸黏膜完整性的首要物理屏障[5]。當緊密連接蛋白表達下降時，會破壞腸道屏障的完整性，使腸道通透性加大，內(nèi)毒素移位，激活機體的免疫炎癥反應。

本病在中醫(yī)屬“虛勞”范疇。多項臨床研究表明，艾灸療法可有效改善疲勞與精神狀態(tài)，緩解胃腸道癥狀，提高患者生存質(zhì)量[6]。雖然艾灸治療CFS的療效確切，但關于其機制的探索尚未完全明晰，研究多集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而從外周系統(tǒng)，尤其是腸道角度，探究其作用機制的研究仍然較少。本實驗通過觀察艾灸干預后CFS模型大鼠的一般情況、結(jié)腸組織病理學以及對結(jié)腸緊密連接蛋白表達的變化，探究艾灸抗慢性疲勞的機制，為今后CFS的臨床診療與應用推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡5～6周。大鼠自由飲食水，飼養(yǎng)在溫度20～23℃、濕度40%～70%的環(huán)境中。實驗大鼠由青島市實驗動物和動物實驗中心提供。實驗動物許可證編號SCXK(魯)2014-0001。實驗過程符合黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗室使用及倫理標準(批準號：2018062001)。

在大鼠適應性飼養(yǎng)的第4～7 天進行適應性跑步，訓練速度為10 m/min、15 m/min、20 m/min，每天30 min。通過篩選，剔除不會跑步與排便異常的大鼠。

1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑：北京天根生化科技公司；引物：蘇州金唯智生物科技有限公司；Occludin兔源多克隆抗體、ZO-1兔源多克隆抗體、山羊抗兔IgG-HRP抗體：北京博奧森公司；伊紅染液、蘇木素染液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。大鼠實驗用細艾條(7 mm×12 mm)：南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司。大鼠跑步機：北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司；LED燈：nVc/雷士LED燈；音箱：HYUNDAI/現(xiàn)代音箱；病理切片機：上海徠卡儀器有限公司；顯微鏡：日本，OLYMPUS；酶標儀：美國，SpectraMax；電子天平：德國，利多斯；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀：美國，伯樂；Real-Time PCR 儀：美國，ABI；臺式高速大容量離心機：德國，Eppendorf；紅外線測溫儀：深圳市萊訊特科技有限公司。

1.3 造模方法 制備模型方法為多因素誘導的復合應激方法[7]。應激方式包括跑臺訓練+束縛應激+睡眠干擾+擁擠處理4種，造模時長35 d。①跑臺訓練：每日7:00開始，以小組(每6只大鼠)為單位進行跑步1 h，速度20 m/min；②束縛應激：跑步1 h后，將造模大鼠置于自制束縛桶中2 h；③睡眠干擾：包括強光和噪音刺激。每日19：00～7：00，將大鼠置于充足日光燈照射和循環(huán)播放搖滾音樂(70～80 dB)的房間中；④擁擠處理：保證大鼠每日擁擠21 h。擁擠方式是將每3只大鼠放置于一個小飼養(yǎng)籠(25 cm×14 cm×14cm)中，共同攝食和飲水。

1.4 動物分組與干預處理 按照隨機數(shù)字表法，將大鼠分為正常組12 只和造模組36 只。CFS建模成功的大鼠隨機分為3組，模型組、艾灸A組和艾灸B組，每組12只。繼續(xù)造模并艾灸35 d。①正常組：正常飼養(yǎng)；②模型組：僅捆綁不干預；③艾灸A組：溫和灸神闕(臍中央)、關元穴(臍下25 mm)，距穴位2.5 cm施灸；④艾灸B組：溫和灸雙側(cè)足三里穴(腓骨小頭下5 mm)，距穴位2.0 cm施灸。腧穴定位依據(jù)《實驗針灸學》[8]。每次灸10 min，每日1次。使用紅外線測溫儀記錄穴位皮膚溫度，保證溫度在41～45 ℃。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 一般情況評價 在整個實驗過程中，對大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、攝食攝水量、活動情況、皮毛色澤、耳尾顏色和糞便形態(tài)進行實時評估和記錄。

1.5.2 結(jié)腸組織病理學觀察 取大鼠結(jié)腸組織，經(jīng)乙醇溶液逐級脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋，制成3 μm病理組織切片。常規(guī)脫蠟后進行HE染色，脫水封片。于光鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)。

1.5.3 結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達檢測 采用Western blot法。取大鼠結(jié)腸組織，研磨成勻漿后裂解，上清提取總蛋白，用BCA法定量蛋白濃度。取50 μg樣本加入適量5×蛋白上樣緩沖液，使樣本變性，并進行SDS-PAGE電泳分離。于250 mA恒流和PVDF膜條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h；依次加入一抗(ZO-1濃度 1∶500；Occludin濃度 1∶500)、二抗(羊抗兔IgG-HRP濃度 1∶3 000)，進行封閉和抗體孵育。瀝干PVDF膜，進行ECL顯色。最后放入全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像，使用Gelpro32對條帶進行灰度值分析。

1.5.4 結(jié)腸組織ZO-1和Occludin mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取大鼠結(jié)腸組織，使用Trizol提取總RNA。檢測RNA濃度，進行DNA體外反轉(zhuǎn)錄，引物序列見表1。最后進行RT-PCR程序擴增。用2-ΔΔCt計算正常對照組、模型組和艾灸A、B組大鼠ZO-1、Occludin基因的相對表達情況。

表1 ZO-1和Occludin mRNA引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后，大鼠體質(zhì)量明顯降低，攝食水量減少，出現(xiàn)毛發(fā)枯槁、精神倦怠、活動減少、耳尾顏色蒼白、便質(zhì)稀軟等表現(xiàn)。艾灸組大鼠的體質(zhì)量、攝食和攝水情況改善不明顯，精神狀態(tài)較活躍，皮毛光澤度恢復，耳尾和爪甲顏色轉(zhuǎn)紅，便質(zhì)成形。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學觀察結(jié)果 見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學觀察(HE，×100)

正常組大鼠結(jié)腸黏膜光滑，組織結(jié)構基本完整，黏膜細胞間緊密連接，無水腫及炎性浸潤。CFS模型大鼠可見結(jié)腸組織整體結(jié)構異常，黏膜層充血水腫，伴有少量炎癥細胞浸潤(黑色箭頭)；杯狀細胞數(shù)量減少且受損萎縮，排列疏松紊亂(黑色漸變箭頭)；黏膜下層及肌層可見大量炎癥細胞浸潤(白色箭頭)。艾灸組大鼠結(jié)腸組織上述結(jié)構的病理改變明顯減輕，黏膜層正常，黏膜上皮未見斷裂脫落；杯狀細胞的數(shù)量較模型組明顯增多(黑色漸變箭頭)，形態(tài)充盈且排列致密，但在肌間仍可見血管擴張充血(白色漸變箭頭)，以及少量炎癥細胞浸潤改變(白色箭頭)。艾灸A組僅肌間可見少量炎癥細胞，而艾灸B組黏膜層及肌間均有少量炎癥細胞。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織緊密連接ZO-1和Occludin蛋白表達檢測結(jié)果 見圖2～圖3。

由圖2～圖3可見，與正常組相比，CFS模型大鼠的結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達降低(P<0.01)。與模型組相比，艾灸A、B組大鼠的ZO-1和Occludin水平均明顯升高(P<0.01)，呈現(xiàn)艾灸A組>艾灸B組>模型組的趨勢。此外，在結(jié)腸Occludin蛋白的表達上，可見艾灸A組在統(tǒng)計學上是高于艾灸B組的，具有明顯差異(P<0.01)，而兩組在ZO-1蛋白表達上則未見明顯差異(P>0.05)。

注：兩組間比較，*P<0.05，*P<0.01(動物數(shù)：12 只)

注：兩組間比較，*P<0.05，*P<0.01(動物數(shù)：12 只)

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織緊密連接ZO-1、Occludin mRNA表達檢測結(jié)果 見圖4～圖5。

由圖4～圖5可見，模型組大鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin基因的相對表達明顯低于正常組(P<0.01)。艾灸組大鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin的基因表達量顯著升高(P<0.01)。兩艾灸組分別與正常組比較，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時，艾灸A、B組的組間比較也無差異(P>0.05)。

注：兩組間比較，*P<0.05，*P<0.01(動物數(shù)：12 只)

注：兩組間比較，*P<0.05，*P<0.01(動物數(shù)：12 只)

3 討論

近年來，CFS的患病率日益增高。流行病學調(diào)查顯示全球的發(fā)病率高達0.4%～2.5%[9]，影響近0.9%人口的健康[10-11]，已成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)CFS患者常伴有消化系統(tǒng)的功能紊亂，伴有腸易激綜合征的患者，出現(xiàn)疲勞的情況更加嚴重[12]。由于CFS的臨床表現(xiàn)多樣，且病因病機不明確，目前仍缺乏有效的治療方法[1]?？诜嫔茉谝欢ǔ潭壬细纳莆改c道功能和疲勞狀態(tài)，但僅為對癥治療，且遠期療效欠佳[13]。

在中醫(yī)領域，CFS可歸屬為“虛勞”“虛損”的范疇。其病機多責之臟腑功能失調(diào)和氣血運行失常。艾灸能助氣血運行以充養(yǎng)臟腑，培元固本以補周身陽氣。《靈樞·邪氣臟腑并形篇》中提到“陰陽皆虛，火自當之”。久虛之人必陽氣衰微，艾灸可振奮元陽，強壯身體。此外，艾灸還可溫通經(jīng)絡，調(diào)理胃腸?！鹅`樞·經(jīng)脈》中云：“灸則強食生肉”，身強體健則疲勞感自除。本實驗選取的神闕、關元和足三里穴皆為人體保健抗疲勞的要穴，是國醫(yī)大師孫申田教授的多年臨證經(jīng)驗。神闕和關元穴內(nèi)系十二經(jīng)脈，五臟六腑，外達四肢百骸，是人體真元之所在，具有平衡陰陽和溝通內(nèi)外的作用；兩穴均位于腹部，艾灸兩穴不僅能夠抗疲勞，還能將溫熱之力直達胃腸，調(diào)節(jié)胃腸道功能。足三里穴為胃經(jīng)的下合穴，足陽明胃經(jīng)多氣多血，艾灸此穴能通調(diào)脾胃，濡養(yǎng)肌肉，補后天之本以改善疲勞。

研究表明CFS患者腸黏膜屏障功能受損[3-4]。作為腸黏膜屏障的第一門戶，腸上皮屏障是由腸上皮細胞和鄰近細胞間的緊密連接共同構成。導致腸上皮屏障損傷的主要原因是緊密連接功能喪失。Occludin和ZO-1是腸上皮屏障中重要的緊密連接蛋白，對于調(diào)節(jié)腸上皮細胞旁的滲透性至關重要。其中，Occludin是構成緊密連接的主要成員，主要負責調(diào)控大分子的選擇通過性，在維持腸道結(jié)構穩(wěn)定性與功能特性方面發(fā)揮關鍵作用[5]。ZO-1是一種緊密連接的特異性蛋白，常用來客觀評估腸道物理屏障功能和通透性高低[5]。已有研究指出，Occludin和ZO-1可以作為評價CFS腸道緊密連接屏障完整性的代表性指標[14]。

在本研究結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)CFS模型大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫，杯狀細胞數(shù)量減少，而炎癥細胞大量分泌，同時伴隨ZO-1，Occludin蛋白和基因的表達明顯下調(diào)；提示慢性疲勞狀態(tài)下，大鼠結(jié)腸組織炎性改變，腸上皮屏障的結(jié)構與功能破壞。在分別艾灸神闕、關元穴和雙側(cè)足三里穴后，可見結(jié)腸組織結(jié)構損傷恢復，通過提高Occludin和 ZO-1蛋白和基因的相對表達量，修復CFS模型大鼠受損的緊密連接。通過對大鼠一般情況的觀察，筆者認為艾灸能夠緩解疲勞，尤其以活躍CFS模型大鼠精神狀態(tài)與促進便質(zhì)成形為突出表現(xiàn)；但艾灸干預后，大鼠體質(zhì)量、攝食和攝水情況仍未見明顯改變，考慮是治療時大鼠依然處在小飼養(yǎng)籠中繼續(xù)造模，擁擠的環(huán)境制約了主觀活動，極大影響了體質(zhì)量和飲食水量的恢復。此外，本研究提示，艾灸兩組在對CFS模型大鼠腸道屏障的修復上也存在差異。艾灸神闕、關元穴調(diào)節(jié)Occludin蛋白表達的能力優(yōu)于艾灸足三里穴，可能是由于神闕和關元穴毗鄰腹部，能夠?qū)⒋碳ぷ饔弥边_胃腸，明顯修復腸道緊密連接結(jié)構。綜上，保護腸道緊密連接的完整性可能是CFS診療的靶點之一。艾灸對CFS模型大鼠的治療作用可能是通過改善結(jié)腸黏膜組織形態(tài)，促進緊密連接蛋白的表達，修復損傷的腸黏膜屏障，從而抑制炎癥反應，間接發(fā)揮神經(jīng)保護作用。