許美芬，梁玲芝，徐友文

(臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318000)

中國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家，WHO估計(jì)我國(guó)出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬(wàn)例。有研究表明，育齡女性體內(nèi)葉酸缺乏是引起胎兒出生缺陷的主要因素，而葉酸攝入不足和由遺傳因素引起的葉酸利用率障礙是體內(nèi)葉酸缺乏的主要原因。MTHFR是葉酸的代謝關(guān)鍵酶，最常見(jiàn)的兩種突變位點(diǎn)為C677T 和A1298C。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出，基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病、神經(jīng)管缺陷和新生兒自閉癥等疾病有關(guān)，而基因多態(tài)性存在種族及地域的差異性。本研究調(diào)查臺(tái)州地區(qū)育齡女性基因C677T和A1298C位點(diǎn)基因型分布，并與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)進(jìn)行比較，進(jìn)而闡明本地區(qū)女性基因的遺傳特征，以期能幫助臨床醫(yī)生針對(duì)性制定個(gè)體化葉酸補(bǔ)充方案，從而有效預(yù)防和降低出生缺陷的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年4月—2019年4月在臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院)進(jìn)行孕前或孕期檢查的女性1 376名，平均年齡(29.39±4.84)歲。本研究經(jīng)臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè) 采集研究對(duì)象靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝。按照血液基因組DNA提取試劑盒(蘇州天隆生物技術(shù)有限公司)的說(shuō)明書(shū)提取研究對(duì)象的基因組DNA，采用熒光定量PCR法檢測(cè)C677T和A1298C基因多態(tài)性。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃總變性 10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，40個(gè)循環(huán)后 60 ℃采集熒光。根據(jù)葉酸代謝能力測(cè)定試劑盒(江西諾德醫(yī)療器械有限公司)說(shuō)明書(shū)及熒光采集量判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用HaploView 4.2軟件進(jìn)行SNPs的Hardy-Weinberg 平衡，LD水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，對(duì)基因型及等位基因頻率進(jìn)行檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡分析結(jié)果基因C677T位點(diǎn)基因型有野生型CC、雜合型CT和突變型TT；基因A1298C位點(diǎn)基因型有野生型AA、雜合型AC和突變型CC。本研究對(duì)象基因C677T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(>0.05)，表明本研究對(duì)象具有該區(qū)域的群體代表性。

2.2 基因型分布特征 本研究中1 376名女性的基因C677T位點(diǎn)以雜合型CT為主，A1298C位點(diǎn)以野生型AA為主。將兩位點(diǎn)的基因型分布特征與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：臺(tái)州地區(qū)女性基因C677T位點(diǎn)的基因型分布特征與瓊海、南寧、武漢、烏魯木齊、遼源、煙臺(tái)、廊坊和新鄉(xiāng)比較，基因A1298C位點(diǎn)的基因型分布特征與瓊海、南寧、長(zhǎng)沙、遼源、煙臺(tái)、廊坊和新鄉(xiāng)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同地區(qū)女性MTHFR 基因C677T和A1298C位點(diǎn)基因型分布特征[n(%)]

2.3 等位基因分布特征 將本研究中基因C677T和A1298C位點(diǎn)的等位基因分布特征與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：臺(tái)州地區(qū)女性基因C677T位點(diǎn)等位基因C、T和A1298C位點(diǎn)等位基因A、C分布情況與湘潭、昆明比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)；與瓊海、南寧、遼源、煙臺(tái)、廊坊和新鄉(xiāng)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同地區(qū)女性MTHFR 基因C677T和A1298C位點(diǎn)等位基因分布特征[n(%)]

2.4C677T 和 A1298C位點(diǎn)連鎖情況及單倍型分析結(jié)果 本研究中最常見(jiàn)的組合是CT/AA(31.5%，433/1 376)，其次是CC/AC(19.0%，261/1 376)、CC/AA(17.9%，246/1 376)、TT/AA(14.4%，199/1 376)、CT/AC(12.4%，171/1 376)，CC/CC(4.8%，66/1 376)，未檢測(cè)到TT/AC、TT/CC和CT/CC這3種組合。HaploView 4.2 軟件分析結(jié)果顯示：臺(tái)州地區(qū)女性C677T和A1298C兩位點(diǎn)構(gòu)建的單倍型有3種組合，即677C/1298A(43.1%)、677T/1298A(36.4%)、677C/1298C(20.5%)，兩位點(diǎn)間存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象(D’=1.0)。

2.5基因C677T和A1298C兩位點(diǎn)基因型代謝型分布 臺(tái)州地區(qū)1 376名育齡女性基因代謝型以較弱代謝型為主，正常代謝型為36.85%。見(jiàn)表3。

表3 臺(tái)州地區(qū)1 376名育齡女性MTHFR 基因C677T和A1298C兩位點(diǎn)基因型代謝型分布

3 討論

的主要生理功能是催化5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF)轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，后者是體內(nèi)重要的甲基供體，在同型半胱氨酸復(fù)甲基化生成蛋氨酸的過(guò)程中參與同型半胱氨酸的代謝?；蜃畛Ｒ?jiàn)的兩種突變位點(diǎn)為C677T 和A1298C，C677T 突變是一種常見(jiàn)的不耐熱錯(cuò)義突變，該位點(diǎn)發(fā)生突變將導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性下降，以致酶活性降低。與野生型相比，純合突變和雜合突變后酶活性分別為原來(lái)的32%和64%。A1298C這一突變位點(diǎn)位于酶的S-腺苷蛋氨酸調(diào)節(jié)域，其與的結(jié)合可通過(guò)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變抑制酶的活性，同樣使酶活性下降。有研究表明，當(dāng)以上兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生雜合突變時(shí)，即677CT/1298AC 基因型，其的酶活性?xún)H為野生型的36%，這將造成葉酸代謝障礙，大大增加了新生兒神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合征及唇腭裂等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于這類(lèi)人群則需要補(bǔ)充更大劑量的葉酸才能達(dá)到預(yù)期的效果。

目前，尚未有臺(tái)州地區(qū)大樣本育齡女性葉酸代謝基因的報(bào)道，本研究對(duì)臺(tái)州地區(qū)育齡女性基因C677T和A1298C位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果顯示：C677T位點(diǎn)的CC、CT和TT基因型頻率分別為41.6%、43.9%和14.5%，A1298C基因位點(diǎn)的AA、AC和CC基因型頻率分別為63.8%、31.4%和4.8%，C677T位點(diǎn)的等位基因C、T的頻率分別為63.6%、36.4%，A1298C位點(diǎn)的等位基因A、C的頻率分別為79.5%、20.5%。進(jìn)一步與其他已報(bào)道地區(qū)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：C677T和A1298C位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率與已報(bào)道的遼源、廊坊、煙臺(tái)、南寧、瓊海和新鄉(xiāng)等地差異顯著。分析發(fā)現(xiàn)，本研究中C677T位點(diǎn)的TT型頻率為14.5%，符合南方城市(瓊海6.2%、南寧7.7%、湘潭12.6%)TT型頻率低于北方城市(烏魯木齊24.1%、煙臺(tái)32.2%、廊坊33.9%)的分布特點(diǎn)，這也與我國(guó)神經(jīng)管出生缺陷發(fā)病率呈現(xiàn)“南低北高”的現(xiàn)象相符，究其原因可能與研究對(duì)象的種族、地區(qū)和遺傳背景等不同密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，臺(tái)州地區(qū)育齡女性C677T和A1298C兩位點(diǎn)最常見(jiàn)的組合是 CT/AA(31.5%)，未檢測(cè)到TT/AC、TT/CC和CT/CC這3種組合；C677T 和 A1298C兩位點(diǎn)存在單倍型連鎖不平衡，這與陳徐等的報(bào)道相一致。本研究中，育齡女性的基因代謝型正常代謝型才占36.85%，這意味著超過(guò)60%的育齡女性存在葉酸代謝障礙的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)存在突變基因型而引起葉酸代謝能力障礙的女性而言，補(bǔ)充0.4 mg常規(guī)劑量的葉酸并不能達(dá)到預(yù)期的效果，需要更多的葉酸量才能減少孕期疾病的發(fā)生，降低新生兒缺陷的發(fā)生率。

綜上所述，臺(tái)州地區(qū)育齡女性C677T和A1298C兩位點(diǎn)的基因型及等位基因分布具有區(qū)域特異性。因此，通過(guò)開(kāi)展葉酸代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性的大樣本分子流行病學(xué)調(diào)查，篩選出葉酸代謝障礙的育齡女性，根據(jù)其基因型為育齡婦女制定個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充方案，為指導(dǎo)本地區(qū)育齡女性合理選擇葉酸劑量提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。