董玥，閆慧明，多慧玲，趙雯紅，孫姍姍，陳文軍

石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050000

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是常見和難治的腎小球疾病，其發(fā)病機制尚不明確，西醫(yī)以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑來降低蛋白尿、提高血漿蛋白、降低血脂、保護腎功能[1]，但伴有股骨頭壞死、肝腎毒性等副作用，停藥后易復(fù)發(fā)，且仍有近30%的患者會在5～10年內(nèi)進展為終末期腎疾病[2]，對家庭和社會造成嚴重的負擔(dān)，如何有效的治療MN是腎內(nèi)科面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。隨著中醫(yī)對MN認識和研究的加深發(fā)現(xiàn)，中西醫(yī)結(jié)合能夠有效提高整體治療效果[3-4]，降低不良反應(yīng)，受到廣大患者的歡迎。“通因通用”出自《素問·至真要大論》，是指用通利藥治通利病癥的方法，適用于因?qū)嵭皟?nèi)阻出現(xiàn)通泄癥狀的真實假虛證[5]。MN患者體內(nèi)大量免疫復(fù)合物沉積腎小球基底膜，造成基底膜斷裂，蛋白尿升高，形成通利的假象，本質(zhì)是不通[6]。趙玉庸教授總結(jié)“腎絡(luò)瘀阻”是MN的基本病機特點[7]，而活血化瘀通絡(luò)是治療MN蛋白尿的基本原則。此次研究建立MN大鼠模型觀察基于通因通用理論補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方治療MN的效果，并初步闡明其作用機制。

1 材料

1.1 動物100只健康雄性 SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(170±10) g，來自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK(冀)2020-001。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院SPF級動物房，25 ℃恒溫，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間可自由飲水、進食。檢測尿蛋白均為陰性后用于后續(xù)實驗。

1.2 藥物與試劑鹽酸貝那普利片(深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20054771，規(guī)格：5 mg)；黃芪、土茯苓、積雪草、丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎(石家莊市中醫(yī)院中藥房提供)。Trizol試劑(美國Invitrogen公司，貨號：10296028)；熒光定量PCR試劑(美國Bio-Rad公司，貨號：10039761)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientifi公司，貨號：K1691)；陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin，C-BSA)凍干粉[依科賽生物科技(太倉)有限公司，貨號：excell.C-BSA00025]；弗氏不完全佐劑 (德國Biofroxx公司，貨號：2203ML010)；雙縮脲試劑(AB液，北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GL1492)；山羊血清(艾美捷科技有限公司，貨號：005-000-121)；平足蛋白抗體(Podoplanin，美國Abcam公司，貨號：ab109059)；α-平滑肌肌動蛋白抗體(α- smooth muscle actin，α-SMA，美國Abbkine公司，貨號：ABM0052)；山羊抗大鼠IgG H&L(美國Abcam，貨號：ab150157)；DAB溶液(二氨基聯(lián)苯胺法，西安齊岳生物科技有限公司，貨號：100582)；大鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)ELISA試劑盒(上海佰利萊生物科技有限公司，貨號：BLL100955E)；大鼠三酰甘油(triglyceride，TG)、D-二聚體(D-dimer，D-D)ELISA試劑盒(上?？撇┤鹕锟萍加邢薰?，貨號：KBR-PD5878S、KBR-PD5597S)；大鼠總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，Alb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP13059、SP13429、SP30121、SP12839)。

1.3 儀器7170A型全自動生化分析儀(日本日立公司)；A2-8型電熱恒溫水浴鍋(天津太斯特設(shè)備廠)；TDL-60C型高速離心機(上海安亭科技儀器廠，離心半徑：13.5 cm)；MIKROTOME-M型石蠟切片機(美國PERKINELMER公司)；CX33型顯微鏡(日本Olympus公司)；Image-Pro Plus 7型多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司)；VORTEX-5型渦旋混合器(海門市其林貝爾公司)；NanoDropTM3300型分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；H7500型透射電子顯微鏡(日本HITACHI株式會社)；7500 Fast Dx型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方組方藥材(黃芪20 g、土茯苓15 g、積雪草15 g、丹參15 g、川芎12 g、地龍9 g、水蛭3 g、全蝎3 g)，經(jīng)水浸泡后煎煮，濃縮至每毫升煎煮液含生藥2.5 g備用。

2.2 動物分組、造模與給藥從100只大鼠中隨機選擇15只作為空白對照組，剩余85只參照Border法[8]采用 C-BSA尾靜脈注射法復(fù)制膜性腎病動物模型，具體如下：1 mg C-BSA凍干粉加入到0.5 mL PBS中，并與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲充分乳化后取適量乳化液于大鼠腋下、腹股溝多點皮下注射進行預(yù)免疫(共6個部位，每個部位 0.05 mL)，隔日1次，共3次。1周后進行正式免疫，將2.5 mg C-BSA加入到1 mL PBS中進行尾靜脈注射，每周3次，每次1 mL，共注射4周。4周后使用雙縮脲試劑(AB液)檢測大鼠24 h尿蛋白，當(dāng)大鼠24 h尿蛋白超過20 mg/24 h時，視為造模成功。將85只造模成功的大鼠隨機分為模型組、貝那普利組、補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方低、中、高劑量組。貝那普利組給予10 mg·kg-1的鹽酸貝那普利溶液灌胃，補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方低、中、高劑量組大鼠分別給予 7.5 g·kg-1、15.0 g·kg-1、22.5 g·kg-1的補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方溶液，空白對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，每只 3 mL，每日1次，連續(xù)4周。

2.3 24 h尿蛋白檢測采用代謝籠分別在造模前、給藥前和給藥后收集各組大鼠的24 h尿液，檢測24 h尿蛋白含量，所有操作嚴格按照試劑盒說明書步驟執(zhí)行。

2.4 全自動生化分析儀測定血清相關(guān)指標(biāo)末次給藥后腹腔注射水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min后分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、D-D、TP、Alb、ALT、AST等生化指標(biāo)的水平。

2.5 HE染色觀察腎小球基底膜、足細胞的病理變化取血后斷頭處死大鼠，摘除左腎，取適量腎皮質(zhì)固定后包埋、切片，HE染色后在光鏡下觀察腎小球基底膜、足細胞的病理變化。

2.6 免疫組化法檢測腎組織Podoplanin、α-SMA的表達水平所有大鼠均采用免疫組化法檢測腎組織Podoplanin、α-SMA陽性表達情況。石蠟切片經(jīng)烘烤、脫蠟后室溫孵育30 min，加入枸櫞酸鹽酸緩沖液進行抗原修復(fù)，加入10%山羊血清封閉，加入Podoplanin、α-SMA一抗(稀釋比例為1200)，4 ℃冰箱孵育過夜；次日復(fù)溫后滴加Podoplanin、α-SMA二抗(稀釋比例為110 000)孵育30 min；使用DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察陽性表達；每張切片隨機選擇5個非重疊視野，通過Image Pro Plus軟件測算平均積分光密度，以此反映Podoplanin、α-SMA陽性表達情況。

2.7 實時熒光定量PCR測定腎組織PodoplaninmRNA、α-SMAmRNA的表達Trizol法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系(10 μL)：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL；PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL；隨機引物(0.2 μg·μL-1) 0.5 μL；總RNA 0.5 μg；DEPC水補至10 μL。取適量cDNA進行熒光定量PCR檢測，擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目的RNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 24 h尿蛋白比較造模前，各組大鼠24 h尿蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；給藥前，與空白對照組比較，其余組大鼠24 h尿蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，且均超過20 mg/24 h，表示造模成功。給藥后，與空白對照組比較，模型組大鼠的24 h尿蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠的24 h尿蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方高劑量組大鼠的24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較

3.2 血清生化指標(biāo)比較與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、D-D的水平明顯升高(P<0.05)，TP、Alb的水平明顯降低(P<0.05)，而ALT、AST的水平無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TC、TG、D-D的水平明顯降低(P<0.05)，TP、Alb的水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

3.3 各組大鼠腎組織病理變化比較空白對照組大鼠的腎組織無明顯異常；模型組基底膜增厚，腎小球體積增大，伴有輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性，腎間質(zhì)無明顯病變；各給藥組基底膜增厚減輕，腎小球體積增大改善，輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性明顯減少。見圖1。

3.4 各組大鼠腎組織Podoplanin、α-SMA陽性表達情況比較與空白對照組比較，模型組Podoplanin蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組Podoplanin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方各劑量組Podoplanin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3及表4。

表4 各組大鼠Podoplanin、α-SMA蛋白表達情況

注：A：空白對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方低劑量組；E：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方中劑量組；F：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方高劑量組圖2 各組大鼠腎組織Podoplanin陽性表達(×400)

注：A：空白對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方低劑量組；E：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方中劑量組；F：補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方高劑量組圖3 各組大鼠腎組織α-SMA陽性表達(×400)

3.5 腎組織PodoplaninmRNA、α-SMAmRNA表達情況比較與空白對照組比較，模型組大鼠腎組織PodoplaninmRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)，α-SMAmRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組PodoplaninmRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMAmRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠Podoplanin mRNA、α-SMA mRNA表達情況比較

4 討論

MN是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名詞，中醫(yī)古籍中并無該病明確的記載。由于該病以高度水腫為主要臨床表現(xiàn)，故中醫(yī)學(xué)將其納入“水腫”的范疇?！毒霸廊珪酚涊d：“凡水腫等證，乃肺脾腎三臟相干之病”?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)，脾腎虧虛、腎絡(luò)瘀阻為貫穿MN的基本病機[9]，以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標(biāo)。本病多發(fā)于中老年人，先天稟賦不足致脾腎虧虛，水液失其運化，內(nèi)停泛溢于肌膚，發(fā)為水腫[10-11]。脾虛則清不得升，濁不得降，腎虛則固攝無權(quán)，久之精微下泄，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)為尿蛋白水平異常。先天不足，加之后天失養(yǎng)，脾腎虧虛至氣血運行不暢，發(fā)為血瘀?！梆觥钡男纬蓜t加重氣血運行障礙、體虛和脾腎虧虛，形成惡性循環(huán)[12]。本次研究從“通因通用”傳統(tǒng)理論出發(fā)，結(jié)合基本病機，認為疏通“腎絡(luò)”為治療關(guān)鍵[13-14]，當(dāng)以補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方治療。方中黃芪為君藥，善于健脾補腎、益氣固表；臣藥土茯苓、積雪草解毒化濁，丹參、川芎行氣活血、破血逐瘀，合黃芪升降并用、攻補兼施，以達補腎氣、化瘀濁、通腎絡(luò)之效；并佐以蟲類藥地龍、水蛭、全蝎，以求“追拔沉混氣血之邪，搜剔絡(luò)中混處之邪”，可破血逐瘀、入絡(luò)搜剔、松透病根、直達病所。諸藥共用，共奏補腎泄?jié)帷⒒鐾ńj(luò)之功?，F(xiàn)代藥理研究也顯示，黃芪具有調(diào)節(jié)免疫，減少腎性尿蛋白的功效[15]，還可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，保護腎臟。

通過對比不同組大鼠腎組織的病理變化發(fā)現(xiàn)，補腎泄?jié)?、化瘀通絡(luò)中藥對MN具有良好的治療效果，表現(xiàn)為基底膜增厚減輕，腎小球體積增大改善，輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性明顯減少。蛋白尿是體現(xiàn)腎臟病變程度的重要指標(biāo)，高水平蛋白尿也是導(dǎo)致MN向終末期發(fā)展的危險因素[16-17]，控制其水平是MN治療的關(guān)鍵，并可延緩腎臟疾病的進展。同時，MN患者大多伴有不同程度低蛋白血癥和血脂代謝紊亂[18]。本次研究結(jié)果顯示，給藥后大鼠24 h尿蛋白定量水平明顯降低，且以中藥高劑量組降低最為顯著；通過對血脂、腎功能相關(guān)指標(biāo)觀察顯示，與模型組比較，各給藥組TC、TG、D-D明顯降低，TP、Alb明顯升高，證實補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方通過降低24 h尿蛋白定量、提高血清白蛋白，改善血脂代謝，降低腎損傷，延緩疾病進展。

隨著對MN研究不斷地深入，發(fā)現(xiàn)足細胞轉(zhuǎn)分化是導(dǎo)致蛋白尿的重要因素[19]。足細胞是腎小球濾過膜的重要組成部分，是腎小球作為濾過屏障的最后一道防線[20]，其附著于腎小球基底膜外側(cè)，足細胞破壞、丟失使濾過屏障完整性遭到破壞，蛋白尿形成。足細胞轉(zhuǎn)分化是足細胞損傷的形式之一[21]。在正常生理狀態(tài)下，足細胞無法生殖再生，一旦發(fā)生病理改變則可恢復(fù)增殖再生的能力，從樹枝分叉狀變成鵝卵石狀、梭形，導(dǎo)致基底膜增厚[22]，形成“釘突”，細胞外基質(zhì)類蛋白增多，導(dǎo)致腎纖維化發(fā)生。足細胞相關(guān)蛋白水平降低，間充質(zhì)類蛋白水平升高，腎小球濾過膜屏障遭到破壞[23]，從而引起蛋白尿。Podoplanin是足細胞裂孔膜相關(guān)蛋白[24]，對于維持足突結(jié)構(gòu)和裂孔膜完整性具有重要作用，發(fā)生足細胞轉(zhuǎn)分化后，足細胞破壞增多、數(shù)量減少，其表達亦隨之減少[25]；α-SMA是新型足細胞間充質(zhì)標(biāo)志物蛋白之一，相關(guān)研究證實，其在足細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中具有較高的參與度[26]。發(fā)生足細胞轉(zhuǎn)分化后，成熟的上皮細胞表型標(biāo)志性蛋白表達降低或消失，導(dǎo)致足突融合、腎小球濾過屏障受損，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[27]。本次實驗研究顯示，經(jīng)過中藥干預(yù)后，Podoplanin蛋白的表達量升高，α-SMA蛋白的表達量降低，說明補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方通過上調(diào)Podoplanin蛋白表達及下調(diào)α-SMA蛋白表達抑制足細胞轉(zhuǎn)分化，維持腎小球濾過屏障功能的完整性，保護腎組織，與陳玲玲[28]等學(xué)者研究得出的結(jié)論具有一致性。

綜上所述，補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方能夠明顯降低MN大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，改善血脂代謝，降低腎損傷，延緩疾病進展，其作用機制可能與上調(diào)Podoplanin蛋白表達，下調(diào)α-SMA蛋白表達，抑制足細胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。該作用機制可能是補腎泄?jié)峄鐾ńj(luò)方治療MN的作用機制之一，仍需在今后的實驗研究中不斷深入。