李井干 吳晶 伏建國(guó) 楊曉軍 張明哲

摘要 [目的]通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物與熒光探針，建立馬達(dá)加斯加龍樹（Didierea madagascariensis）實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法。[方法]提取26份龍樹科植物基因組，并用內(nèi)源基因檢測(cè)DNA質(zhì)量;根據(jù)GenBank中已發(fā)表的馬達(dá)加斯加龍樹的PEPC基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物與熒光探針，通過(guò)檢測(cè)26份供試樣本，檢測(cè)該方法的特異性;將樣品DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，以檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度。[結(jié)果]只有3份馬達(dá)加斯加龍樹樣本出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，其他23份龍樹科植物無(wú)典型的擴(kuò)增曲線;核酸原液與10-1～10-4倍稀釋液樣本均能夠得到典型擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）為0.995，檢測(cè)限量為5.2×10-3 ng/μL。[結(jié)論]該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可有效地應(yīng)用于馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定。

關(guān)鍵詞 馬達(dá)加斯加龍樹;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;鑒定

中圖分類號(hào) Q 943? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0168-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research on Identification of Didierea madagascariensis with Real-time PCR Method

LI Jing-gan，WU Jing，F(xiàn)U Jian-guo et al

（Animal，Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract [Objective]A real-time fluorescent quantitative PCR detection method for Didierea madagascariensis was established by designing specific primers and fluorescent probes.[Method]26 samples of didiereaceae plants were extracted，and DNA quality was detected with endogenous genes.Specific primers and probe were designed according to the published PEPC genes of Didierea madagascariensis and were used to detecting 26 testing samples，the specificity and sensitivity were detected by screening 26 testing samples.The sample DNA was serially diluted 10 times to test the sensitivity of real-time PCR method.[Result]Typical amplification curves could be obtained for 3 Didierea madagascariensis samples，but not for other 23 samples.The nucleic acid stoste and its diluents from 10-1-10-4 times could also be deteced the signals，the determination coefficient （R2）of the standard curve was 0.995 and the detection limit was 5.2×10-3 ng/μL.[Conclusion]The method has strong specificity and high sensitivity，and can be effectively applied to the identification of Didierea madagascariensis.

Key words Didierea madagascariensis;Real-time PCR;Identification

馬達(dá)加斯加龍樹（Didierea madagascariensis）屬龍樹科（Didiereaceae）刺棘木屬（Didierea）[1]，馬達(dá)加斯加特有種，因當(dāng)?shù)厝祟惿?、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、養(yǎng)牛場(chǎng)建設(shè)而變得瀕危[2]，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ。龍樹科葉形多變，線形、梭形、卵形和心形都有，葉常在旱季脫落[3]。目前馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定主要以形態(tài)學(xué)為主，且葉片是鑒定馬達(dá)加斯加龍樹的重要依據(jù)，馬達(dá)加斯加龍樹的葉脫落后，會(huì)給馬達(dá)加斯加龍樹的鑒定帶來(lái)一定難度，因此需要制定分子生物學(xué)的鑒定方法，用于快速準(zhǔn)確鑒定馬達(dá)加斯加龍樹，為口岸進(jìn)境物種的鑒定研究奠定基礎(chǔ)，并有助于瀕危物種的保護(hù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[4]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好及高通量等特點(diǎn)[5]，目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、育種學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域[6-7]，但該方法在瀕危物種的鑒定方面應(yīng)用較少。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）基因在龍樹科植物內(nèi)廣泛存在[8]，根據(jù)馬達(dá)加斯加龍樹PEPC序列特有的保守突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物和熒光探針，研究馬達(dá)加斯加龍樹的分子鑒定方法，并檢測(cè)該方法的實(shí)用性，為瀕危物種的鑒定提供新的方法和思路。4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 所用26份試驗(yàn)材料來(lái)自江蘇南京和福建廈門，均由相關(guān)專家鑒定，采集新鮮植株葉片進(jìn)行試驗(yàn)。樣品的詳細(xì)信息見表1。

1.2 基因組DNA提取

先將供試植物葉片進(jìn)行表面消毒，用液氮研磨成粉，參照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說(shuō)明書上的步驟方法，提取試驗(yàn)樣品基因組DNA。用超微量分光光度計(jì)One drop OD2000+測(cè)定提取樣品DNA濃度。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì)

通過(guò)BioEdit軟件對(duì)馬達(dá)加斯加龍樹的PEPC基因序列與龍樹科其他植物PEPC基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，找出馬達(dá)加斯加龍樹的特異性位點(diǎn)突變區(qū)，應(yīng)用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針。探針5′端含有FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)BHQ1。內(nèi)源基因參照SN/T 1204—2016中18S rRNA序列[9]。具體序列見表2。

1.4 內(nèi)源基因檢測(cè)

應(yīng)用通用植物內(nèi)源基因18S rRNA對(duì)提取樣品基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)待測(cè)樣品是否有典型擴(kuò)增曲線。如未出現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，則說(shuō)明提取的樣品DNA質(zhì)量有問(wèn)題，或DNA提取液中有抑制物質(zhì)，應(yīng)重新提取或純化待測(cè)樣品基因組DNA，直到擴(kuò)增出典型擴(kuò)增曲線。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)所用TaKaRa Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購(gòu)自南京易特派儀器儀表有限公司，核酸提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit購(gòu)自凱杰公司，實(shí)時(shí)熒光PCR儀為ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10.0 μL，上游引物 （10 μmol/L ） 0.8 μL，下游引物 （10 μmol/L） 0.8 μL，探針（10 μmol/L） 0.4 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，補(bǔ)水至20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：94 ℃，15 s;64 ℃，1 min。

1.6 特異性試驗(yàn) 將所有樣品放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，觀察反應(yīng)體系的特異性。

1.7 靈敏性試驗(yàn) 取馬達(dá)加斯加龍樹葉片提取的基因組DNA，以超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，對(duì)DNA進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，取各濃度DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源基因檢測(cè)

用通用植物內(nèi)源基因18S rRNA對(duì)26份提取基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示所有待測(cè)樣品均有典型的擴(kuò)增曲線，其循環(huán)閾值（Ct）在12～20。按照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204—2016，內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值需要小于或等于30。內(nèi)源基因檢測(cè)結(jié)果表明，所提樣品DNA均沒有問(wèn)題，可以進(jìn)行后續(xù)靈敏度和特異性試驗(yàn)。具體結(jié)果見圖1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測(cè)

應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物和熒光探針，對(duì)26份樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示只有3份馬達(dá)加斯加龍樹樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線（圖2）。表明所設(shè)計(jì)的引物和熒光探針對(duì)馬達(dá)加斯加龍樹具有良好的特異性。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度

提取馬達(dá)加斯加龍樹樣品D17基因組DNA后，測(cè)定核酸濃度為52.3 ng/μL。將該樣品DNA進(jìn)行 10倍梯度稀釋，以檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度。擴(kuò)增結(jié)果顯示，核酸原液與10-1～10-4倍稀釋液樣本均能夠得到典型的擴(kuò)增曲線，根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)置閾值線，得到其Ct值分別為23.564、26.522、29.668、33.857、36.646;10-5、10-6和10-7 DNA稀釋液樣本未得到典型的擴(kuò)增曲線，判定為陰性。該靈敏度試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）為0.995（圖3），檢測(cè)限量為5.2×10-3 ng/μL。

3 討論與結(jié)論

CITES的精神在于管制而非完全禁止野生物種的國(guó)際貿(mào)易，其用物種分級(jí)與許可證的方式，以達(dá)成野生物種市場(chǎng)的永續(xù)利用性，我國(guó)于1980年12月25日加入該公約。馬達(dá)加斯加龍樹被列入CITES附錄Ⅱ中，屬于被管制的國(guó)際貿(mào)易對(duì)象。為更好履行CITES公約責(zé)任，提高外來(lái)物種的快速準(zhǔn)確檢測(cè)能力，建立馬達(dá)加斯加龍樹的實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法，不僅對(duì)馬達(dá)加斯加龍樹的保護(hù)具有重要意義，也有助于提升瀕危物種的鑒定水平。

PEPC是C4植物[10]和CAM植物[11]光合作用的關(guān)鍵酶之一，在種子萌發(fā)和形成[12]、調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞[13]、促進(jìn)蘋果酸的合成[14]、植物抗生物和非生物脅迫[15]中有重要作用。PEPC基因具有高度的保守性[16]，已用于鐵皮石斛[17]和菌草[18]的遺傳多樣性分析，表明PEPC基因可以作為物種鑒定的候選片段。

該研究根據(jù)馬達(dá)加斯加龍樹與其他龍樹科物種PEPC序列差異，設(shè)計(jì)開發(fā)了馬達(dá)加斯加龍樹的特異性引物探針，該引物可以將馬達(dá)加斯加龍樹從刺棘木科植物中區(qū)分開來(lái)，表現(xiàn)出了良好的特異性。該方法檢測(cè)限量為5.2×10-3 ng/μL，具有良好的靈敏度，提取的樣品DNA完全能夠滿足檢測(cè)鑒定需要。該方法的建立將有助于植物物種的準(zhǔn)確鑒定工作的開展，對(duì)瀕危物種的保護(hù)具有重要意義，也為我國(guó)CITES履約、海關(guān)執(zhí)法等提供更加科學(xué)準(zhǔn)確的技術(shù)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]

RAUH W.The morphology and systematic position of the Didiereaceae of Madagascar[J].Bothalia，1983，14（3/4）：839-843.4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4

[2] ERBAR C，LEINS P.Floral ontogeny and systematic position of the Didiereaceae[J].Plant systematics and evolution，2006，261（1/2/3/4）：165-185.

[3] 王成聰.探究龍樹科的奧秘[J].園林，2014（1）：20-23.

[4] 廉紅霞，高騰云，傅彤，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量方法研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（10）：128-129，132.

[5] HUGGETT J，DHEDA K，BUSTIN S，et al.Real-time RT-PCR normalisation;strategies and considerations[J].Genes and immunity，2005，6（4）：279-284.

[6] ZIMMERMANN B，HOLZGREVE W，WENZEL F，et al.Novel real-time quantitative PCR test for trisomy 21[J].Clinical chemistry，2002，48（2）：362-363.

[7] KESSLER H H，PREININGER S，STELZL E，et al.Identification of different states of hepatitis B virus infection with a quantitative PCR assay[J].Clinical and diagnostic laboratory immunology，2000，7（2）：298-300.

[8] CHRISTIN P A，ARAKAKI M，OSBORNE C P，et al.Shared origins of a key enzyme during the evolution of C4 and CAM metabolism[J].Journal of experimental botany，2014，65（13）：3609-3621.

[9] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法：SN/T 1204—2016[S].北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[10] HATCH M D.C4 photosynthesis：A unique elend of modified biochemistry，anatomy and ultrastructure[J].Biochimica et biophysica acta（BBA）-reviews on bioenergetics，1987，895（2）：81-106.

[11] BORLAND A M，TAYBI T.Synchronization of metabolic processes in plants with Crassulacean acid metabolism[J].Journal of experimental botany，2004，55（400）：1255-1265.

[12] OLEARY B，F(xiàn)EDOSEJEVS E T，HILL A T，et al.Tissue-specific expression and post-translational modifications of plant-and bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase isozymes of the castor oil plant，Ricinus communis L[J].Journal of experimental botany，2011，62（15）：5485-5495.

[13] COUSINS A B，BAROLI I，BADGER M R，et al.The role of phosphoenolpyruvate carboxylase during C4 photosynthetic isotope exchange and stomatal conductance[J].Plant physiology，2007，145（3）：1006-1017.

[14] NOMURA M，MAI H T，F(xiàn)UJII M，et al.Phosphoenolpyruvate carboxylase plays a crucial role in limiting nitrogen fixation in Lotus japonicus nodules[J].Plant and cell physiology，2006，47（5）：613-621.

[15] CHENG G，WANG L，LAN H Y.Cloning of PEPC-1 from a C4 halophyte Suaeda aralocaspica without Kranz anatomy and its recombinant enzymatic activity in responses to abiotic stresses[J].Enzyme and microbial technology，2016，83：57-67.

[16] SVENSSON P，BLSING O E，WESTHOFF P.Evolution of C4 phosphoenolpyruvate carboxylase[J].Archives of biochemistry and biophysics，2003，414（2）：180-188.

[17] 劉玲，吳睿，牛志韜，等.基于TRAP分子標(biāo)記的鐵皮石斛野生居群的分析與鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（12）：1926-1933.

[18] 梅嘉洺，黃小霞，王詠，等.46份菌草種質(zhì)資源PEPC基因的PCR-RFLP多樣性分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，35，60（11）：45-50，60.4F2A077F-4076-4C23-80F4-03ADEFAA09F4