劉彥恒 代志堅(jiān) 張萌 李峰 夏瑤賓

【關(guān)鍵詞】乳腺增生;慈蓮膠囊;凋亡通路;修復(fù)

中醫(yī)學(xué)將乳腺增生病多稱為“乳癖”，多因情志不暢，肝氣郁結(jié)，氣滯不舒，氣血周流失度，氣滯血疲挾痰，導(dǎo)致乳絡(luò)經(jīng)脈阻塞不通，結(jié)聚乳中為腫塊則引起乳房疼等癥候[1]。內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，觀察臨床發(fā)病率發(fā)現(xiàn)氣滯痰凝型居多，故在原經(jīng)驗(yàn)方“慈蓮?fù)琛钡幕A(chǔ)上加味調(diào)整，擬定并制備了中藥慈蓮膠囊，其以氣滯血疲痰凝為本，治療上重在疏肝行氣、化痰祛疲、散結(jié)止痛，同時(shí)佐以補(bǔ)腎調(diào)攝沖任，方中柴胡、青皮、丹參疏肝行氣、活血化疲為君，山慈菇、半枝蓮化痰軟堅(jiān)散結(jié)為臣，鹿角霜補(bǔ)肝腎、調(diào)攝沖任，諸藥合用共奏行氣活血、化痰散結(jié)。經(jīng)臨床驗(yàn)證，該基本方具有疏肝行氣、活血祛疲、化痰散結(jié)之功效[1]。臨床及藥理試驗(yàn)研究提示其參與性腺軸、激雌激素信號通路及免疫失衡調(diào)節(jié)[2] ，HE染色乳腺組織形態(tài)表明，與模型組比較其對過度增生有明顯的抑制作用，推測其可能參與增生細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)，促進(jìn)其凋亡，抑制組織過度增生并修復(fù)乳腺組織結(jié)構(gòu)。為闡明其療效機(jī)制，本文通過建立大鼠乳腺增生模型，來觀察慈蓮膠囊對凋亡途徑的影響。

細(xì)胞程序性死亡可分為外源性與內(nèi)源性，外源性細(xì)胞凋亡，可由Fas和TNF受體等死亡受體介導(dǎo)，如Fas的配基（Fast）與Fas結(jié)合后，能夠激活凋亡因子caspase-8，次第激活caspase-3，終致細(xì)胞程序性死亡。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，線粒體膜的通透性受外界刺激而改變，即而釋放出的細(xì)胞色素c招募其他凋亡因子形成凋亡體，從而激活caspase-9，次第激活caspase-3，終致細(xì)胞凋亡[3]。

fas廣泛分布于活化T.B細(xì)胞及單核細(xì)胞表面，廣泛表達(dá)于正常組織及腫瘤細(xì)胞上。fasl即fas配體是腫瘤壞死因子家族的細(xì)胞表面分子，僅表達(dá)于活化T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及免疫豁免部位及其他上皮。caspa家族是細(xì)胞啟動凋亡程序的關(guān)鍵，屬于半耽氨酸蛋白酶（caspa、家族）的caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。Fasl、fas和caspase3參與細(xì)胞程序性死亡。fas是靶細(xì)胞膜上的重要的死亡受體，免疫細(xì)胞上fasl與fas結(jié)合，活化并向靶細(xì)胞傳導(dǎo)死亡信號[3]，在靶膜內(nèi)部caspase3接受到從fas傳到的死亡信號，開始執(zhí)行外源性細(xì)胞凋亡程序。而乳腺組織周圍有著豐富的淋巴網(wǎng)和毛細(xì)血管網(wǎng)，T淋巴細(xì)胞可以通過淋巴網(wǎng)和毛細(xì)血管網(wǎng)到達(dá)乳腺組織附近觸發(fā)內(nèi)外源性凋亡機(jī)制使增生的乳腺細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)，而起到保護(hù)和修復(fù)作用。

1 材料

藥品慈蓮膠囊（內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，批號180307，內(nèi)藥制字Z16010006）;獸用苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠生產(chǎn)，批號20180420）;黃體酮注射液（寧波第二激素廠生產(chǎn)，批號180225）;夏枯草膠囊（規(guī)格32 克/瓶，有效期36 個(gè)月，聚協(xié)昌北京藥業(yè)有限公司，20180101 生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字210207747）;他莫昔芬片（四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號1706020）。動物SPF級雌性wistar未孕大鼠，9 周齡，購于內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)院，合格證號SCXK（內(nèi)）2018-0090。

2 研究方法

2.1 造模

雌性大鼠肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，1 次/d，連續(xù)25 d，其后用黃體酮肌注4 mg·kg-1，1 次/d，連續(xù)5 d。造模后光鏡下觀察大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)，根據(jù)乳腺增生大鼠模型病理診斷標(biāo)準(zhǔn) ，造模成功依據(jù)為乳腺小葉增生和導(dǎo)管擴(kuò)張。

2.2 分組及給藥

造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為7 組，即西藥對照三苯氧胺組、中藥對照夏枯草組、慈蓮膠囊高，中、低劑量組，正常組、模型組。慈蓮膠囊的臨床應(yīng)用劑量按成人60 kg 人每日4 g，相當(dāng)于生藥0.95 g，大鼠每日給藥量分別為低（A組）0.063，中（B組）0.316，高（C組）0.632 g·kg-1·d-1;夏枯草組（E組）0.023 g·kg-1·d-1;三苯氧胺組（D組）0.018 g·kg-1·d-1。正常組（G組）、模型組（F組）（以等量水灌胃）：各組每日灌胃1 次，連續(xù)28 d。大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h， 腹腔內(nèi)注射20% 烏拉坦麻醉大鼠。

2.3 乳腺標(biāo)本取材與觀察指標(biāo)

楔形取下大鼠第2對雙側(cè)乳房，用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠乳腺組織中 凋亡蛋白（Fas）和凋亡蛋白配體（Fasl）、抗凋亡基因（survivin）與促凋亡基因（caspase-8）的表達(dá)。

2.4 免疫組化法

取材、固定，將固定后的組織用水沖洗，去除殘留的液及雜質(zhì)。不同濃度的乙醇每級2 h，50%、70%、85%、95%、無水乙醇逐級脫水。純乙醇和二甲苯的等體積混合液中置入組織塊2 h，浸入純二甲苯2 h×2次;置恒溫箱中，先將組織塊浸入熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液，浸漬1～2 h，再先后2 次浸漬于熔化的石蠟液約3 h×2次。包埋后切片，約為4～7 μm。烤片、脫蠟、水化，置于0.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液中，高壓修復(fù)15 min，室溫冷卻后，以0.02 M PBS 洗3 min×3 次。消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，將玻片置于3% H2O2中，于濕盒孵育10 min，以0.02 M PBS 沖洗3 min×3次。一抗孵育：滴加一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 M PBS沖洗3 min×3次。加入HRP，標(biāo)記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min～30 min。以0.02 M PBS沖洗3 min×3次。DAB染色后，以蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察控制染色程度。水沖洗10 min，放入65℃烘箱中烘干。將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，置65℃烘箱中15 min烘干。在顯微鏡下觀察樣本并采集，計(jì)算陽性面積。

3 結(jié)果

凋亡因子在乳房組織的表達(dá)（見表1，圖1～圖6）。Fas陽性分布值A(chǔ)組明顯高于F、G、E組，與D組相似;FasL陽性分布值A(chǔ)組明顯低于F、E，與G、D組相似;caspase-8陽性分布值A(chǔ)組明顯高于F組、E組、G組、D組;survivin陽性分布值A(chǔ)組明顯低于F組、E組，G組于、D組相似。

4 討論

本研究提示慈蓮膠囊治療乳腺增生癥與激活免疫細(xì)胞與增生乳腺細(xì)胞之間的fas、fasL和caspase-8介導(dǎo)信號通路有關(guān)，在此干預(yù)的過程中上調(diào)fas、caspase-8的表達(dá)，并下調(diào)了Fasl蛋白的表達(dá)，使其表達(dá)量接近或低于正常的乳腺組織，具有活性的caspase-8可引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、可激活線粒體途徑凋亡通路和參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。survivin獨(dú)特性表現(xiàn)為在有絲分裂時(shí)呈細(xì)胞周期依賴性表達(dá)，通過抑制caspase-3 和caspase-7來抑制多種凋亡觸發(fā)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以確保細(xì)胞周期G2/M期正常分裂促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[5]。在XIAP BIR域存在的情況下，survivin與所有胱天蛋白酶caspase-3，caspase-7和caspase-9強(qiáng)烈相互作用[6]。慈蓮方下調(diào)了Survivin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡發(fā)生。提示慈蓮膠囊通過參與多個(gè)凋亡通路環(huán)節(jié)抑制了乳腺增生的發(fā)展，促進(jìn)了過度增生細(xì)胞凋亡的過程，發(fā)揮抗增生和修復(fù)作用。