李 姝，王松濤，張 娜，賈俊杰，焦 威，劉 怡，趙 建，沈才洪

(1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州 646000; 2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000; 3.四川大學生命科學學院 資源微生物學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，四川 成都 610064; 4.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041)

0 引 言

大孔樹脂是一種理化特性穩(wěn)定，比表面積較大的多孔微球吸附劑[1-2]。帶有不同功能基的大孔樹脂，其可能通過范德華力、靜電力、氫鍵力等多種吸附力對提取物中的有效成分進行選擇性吸附，由于吸附作用不同，可以通過不同溶劑洗脫吸附的物質(zhì)，由此達到富集目標成分或去除雜質(zhì)的目的。大孔樹脂吸附法以其分離效果好、可重復利用、操作簡便、容易工業(yè)轉(zhuǎn)化等優(yōu)勢，目前已廣泛用于黃酮類、皂苷類、多糖、花色苷等成分的分離純化[3-6]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn.）是一種重要的藥食兩用糧食作物[7]。黃酮類化合物被認為是苦蕎中的主要活性成分，已有研究報道黃酮類化合物具有降三高、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種功效[8-10]。目前，對于黃酮類成分的富集方法較多，其中以大孔樹脂法最為常用有效，不同類型的大孔樹脂中又以AB-8、D101等應(yīng)用較為廣泛[11-13]。項目前期研究發(fā)現(xiàn)相較AB-8、D101型大孔樹脂，ADS-7用于富集苦蕎麩皮中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚4種黃酮類物質(zhì)的效果更佳[14]。雖然近年來采用大孔樹脂富集黃酮的研究越來越多，但涉及大孔樹脂富集苦蕎黃酮使用壽命的文獻尚未見報道。本研究擬通過結(jié)合AlCl3分光光度法及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC），首次考察ADS-7大孔樹脂富集苦蕎黃酮的使用次數(shù)及對苦蕎精制品中4種主要黃酮成分蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚含量的影響，以期為苦蕎黃酮精制品的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

乙醇（純度≥ 95%，食品級）、甲醇（分析純）、AlCl3（分析純）、CH3COOK（分析純），均購于成都市科隆化學品有限公司；蘆?。兌取?99%）、煙花苷（純度≥ 98%）、槲皮素（純度≥ 99%）、山奈酚標樣（純度≥ 98%）均購于成都普思生物科技股份有限公司；苦蕎麩皮原料購于四川環(huán)太生物科技股份有限公司。

1.2 實驗儀器

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津公司）；紫外可見分光光度計（翱藝儀器（上海）有限公司）；SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HZK-FA210萬分之一電子分析天平（福州華志科學儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿(mào)有限公司）；PCWJ-10超純水系統(tǒng)（成都品成科技有限公司）；ADS-7大孔樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司）；玻璃層析柱（上海禾汽玻璃儀器有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 AlCl3分光光度法

本實驗采用AlCl3分光光度法[15]用于測定上樣滴出液、洗雜液及洗脫液中總黃酮的量。

1) 標準曲線的建立

準確稱量蘆丁標樣5.0 mg，置于容量瓶中，70%的甲醇溶液溶解，定容至25 mL，振蕩均勻，靜置，得到0.20 mg/ mL的蘆丁標樣溶液。分別移取上述溶液 0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加入 70% 的甲醇 5 mL，0.1 mol/L 的 AlCl3溶液 2 mL，1.0 mol/L 的 CH3COOK 溶液3 mL，用 70% 的甲醇溶液定容至25 mL，常溫下靜置 0.5 h，紫外分光光度計420 nm處測定吸光度，以空白試劑作為對照。以標樣的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2) 供試液的測定方法

取供試液 0.5 mL于 25 mL容量瓶中，加入70% 的甲醇 5 mL，0.1 mol/L 的 AlCl3溶液 2 mL，1.0 mol/L 的 CH3COOK 溶液 3 mL，70% 的甲醇溶液定容，常溫下靜置0.5 h，紫外分光光度計420 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算上樣滴出液、洗雜液及洗脫液中總黃酮的量。

1.3.2 HPLC 法

實驗采用HPLC法測定苦蕎精制品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚4種主要黃酮成分的含量[14]。根據(jù)標準曲線的回歸方程分別計算4種黃酮的含量，并通過將洗脫液減壓旋蒸至干稱量得總干膏量，由下式計算4種黃酮總含量（純度）：

式中：C1——蘆丁含量，mg/mL；

C2——煙花苷含量，mg/mL；

C3——槲皮素含量，mg/mL；

C4——山奈酚含量，mg/mL；

V——洗脫液總體積，mL；

M——洗脫液總干膏量，mg。

1.4 ADS-7大孔樹脂富集苦蕎黃酮精制品的方法

稱取苦蕎麩皮粉適量，按照料液比為1∶10量取70%食品級乙醇，采用熱回流提取法進行提取，提取溫度為60 ℃，提取 3次，每次3 h。合并3次提取液后過濾，并將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥，即得苦蕎黃酮粗制品。

取適量苦蕎黃酮粗制品，用純水充分稀釋使上樣液濃度為 1 mg/mL。將 50 g ADS-7 大孔樹脂加入適量純水一起拌入層析柱（徑高比=1∶8.4）中，用純水清洗大孔樹脂直至流出液透明澄清為止。隨后以2 BV/h的速度上樣，收集上樣滴出液。再用適量純水清洗大孔樹脂直至流出液透明澄清為止，收集洗雜液。洗雜后采用90%食品級乙醇洗脫吸附于ADS-7大孔樹脂上的黃酮類化合物，收集6 BV亮黃色的洗脫液，減壓濃縮干燥并回收乙醇，得淺黃色粉末，即為苦蕎黃酮精制品[14]。

1.5 ADS-7大孔樹脂使用次數(shù)考察

待完成1次上樣洗脫后，需用純水清洗大孔樹脂至流出液無明顯乙醇氣味為止。沖洗后可繼續(xù)上樣，重復上述操作，收集每次的上樣滴出液、洗雜液及洗脫液，采用AlCl3分光光度法檢測吸光度，以黃酮吸附量、吸附率、解吸率、洗脫液總黃酮量及總干膏量為指標考察大孔樹脂連續(xù)使用的情況。同時，采用HPLC法測定苦蕎精制品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚4種黃酮成分的含量，以探討ADS-7大孔樹脂連續(xù)使用對苦蕎精制品中主要黃酮成分的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

如圖1所示，標準曲線的回歸方程是：y=0.032 6x-0.009 7，相關(guān)系數(shù)為 0.999 9。標樣濃度與吸光度在4.8～24 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 AlCl3法標準曲線

2.2 ADS-7大孔樹脂使用次數(shù)考察

一般認為連續(xù)使用的大孔樹脂當其吸附率降低30%以上的時候，需要考慮停止使用該樹脂或?qū)ζ溥M行強化再生處理[16]。根據(jù)本實驗ADS-7大孔樹脂使用結(jié)果顯示：樹脂在連續(xù)使用30次后，黃酮吸附量僅降低8.9%，黃酮吸附率降低9.3%（見表1），說明ADS-7大孔樹脂在連續(xù)使用30次后，吸附苦蕎黃酮的性能仍較好。從圖2可以看出，ADS-7大孔樹脂在連續(xù)使用25次以內(nèi)，黃酮解吸率、洗脫液總黃酮量和總干膏量在一定范圍內(nèi)波動，在使用25次及以后，黃酮解吸率、洗脫液總黃酮量和總干膏量均有一定程度的上升，說明ADS-7大孔樹脂在連續(xù)使用25次及以后解吸苦蕎黃酮的能力增加，洗脫出的黃酮量增多；而總干膏量的增加意味著可能除黃酮以外的雜質(zhì)也被洗脫出來。

圖2 ADS-7大孔樹脂連續(xù)上樣對苦蕎黃酮吸附量、吸附率、解吸率、洗脫液總黃酮量及總干膏量的影響

表1 ADS-7大孔樹脂使用次數(shù)考察

2.3 ADS-7大孔樹脂連續(xù)使用對苦蕎精制品中4種黃酮成分含量的影響

采用HPLC法測定ADS-7大孔樹脂連續(xù)使用30次所富集的苦蕎精制品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚4種主要黃酮成分的含量（見圖3）。盡管ADS-7大孔樹脂在連續(xù)使用25次及以后洗脫液中總黃酮的量及總干膏量有所增加，但洗脫液中4種黃酮的總含量（純度）在樹脂重復使用25次時陡然降低了20.62%，且隨后一直維持總體降低的趨勢（見表2，圖4），進一步證實了ADS-7大孔樹脂在連續(xù)使用25次及以后洗脫出了除黃酮以外的雜質(zhì)，且洗脫出的雜質(zhì)的量相較黃酮的量的增幅更大?？嗍w精制品中蘆丁和煙花苷含量的變化有類似的趨勢（見圖4），槲皮素和山奈酚含量的變化隨樹脂重復使用次數(shù)的增加總體呈現(xiàn)逐步降低的趨勢（見圖4）?？紤]到槲皮素和山奈酚在苦蕎精制品中的含量較低，對總黃酮含量變化影響不大。因此，綜合衡量黃酮吸附量、吸附率、黃酮純度等指標的檢測結(jié)果，ADS-7大孔樹脂用于富集苦蕎黃酮可連續(xù)使用至第25次。

圖3 大孔樹脂連續(xù)上樣1次、10次、20次、30次苦蕎精制品HPLC圖

圖4 ADS-7大孔樹脂連續(xù)上樣30次對4種黃酮總含量及蘆丁、煙花苷、槲皮素、山奈酚含量的影響

表2 ADS-7大孔樹脂使用次數(shù)對苦蕎精制品中4種黃酮成分含量的影響

3 結(jié)束語

隨著大孔樹脂使用次數(shù)的增加，一些強吸附性的物質(zhì)會保留在樹脂柱上，吸附的雜質(zhì)也會越來越多，導致柱效降低，影響目標成分的富集純化[16-17]。因此，考察大孔樹脂的使用次數(shù)及其對所吸附成分含量的影響對于目標產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

一般情況下，大孔樹脂在重復使用數(shù)次后需要經(jīng)過酸堿再生處理[16-19]。但采用酸堿處理所需要的溶劑量較大，具有一定的危險性，且酸堿再生后所產(chǎn)生的廢液可能對環(huán)境造成一定的不良影響[20]。本研究在前期建立ADS-7大孔樹脂富集苦蕎黃酮工藝方法的基礎(chǔ)上，首次考察了ADS-7大孔樹脂富集苦蕎黃酮的使用次數(shù)及對苦蕎精制品中4種主要黃酮成分蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚含量的影響。通過綜合考慮黃酮吸附量、吸附率、黃酮純度等指標的檢測結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)以天津浩聚樹脂科技有限公司生產(chǎn)的ADS-7大孔樹脂用于富集苦蕎黃酮可連續(xù)使用至第25次，富集過程無需經(jīng)酸堿再生處理，不僅環(huán)保，還可節(jié)約生產(chǎn)成本。本研究為苦蕎黃酮精制品的規(guī)?；a(chǎn)提供了理論依據(jù)和參考。