孫 琦 林 瀟 丁 亮 鄭 磊 朱 英 楊艷偉*

(1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

自然界發(fā)現(xiàn)的元素中金屬、類金屬占比較大，且大部分具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是各行業(yè)不可或缺的材料。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，由金屬特別是重金屬及其化合物造成的環(huán)境污染對(duì)人群健康的影響已引起人們的持續(xù)關(guān)注[1]。人體生物樣本中金屬、類金屬元素含量測(cè)定及形態(tài)分析可在一定程度上反映其暴露水平，對(duì)評(píng)估環(huán)境暴露與人群健康之間的關(guān)系具有重要意義。近年來，除血液、尿液的普遍應(yīng)用外，指甲、頭發(fā)等生物樣本的分析也不斷增加[2]。指甲是皮膚的附屬物，富含角蛋白，對(duì)某些元素如砷、汞等具有較強(qiáng)的吸附能力，有報(bào)道指出有毒金屬元素在指甲中的濃度較體液或其他組織高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。一般而言，血液尿液反映了環(huán)境污染物在較短或有限時(shí)間內(nèi)的暴露，指甲、頭發(fā)則反映了幾周或數(shù)月較長(zhǎng)時(shí)間的暴露。此外，指甲易于取樣、運(yùn)輸和保存，特別是腳趾甲受外部污染的可能性小，可用于職業(yè)場(chǎng)所金屬的暴露監(jiān)測(cè)，如錢秀榮等[3]對(duì)蓄電池廠作業(yè)工人的血鉛、尿鉛和指甲鉛進(jìn)行檢測(cè)，指甲鉛與血鉛有較好的相關(guān)性，可作為職業(yè)性慢性鉛中毒診斷輔助指標(biāo)。

自20世紀(jì)70年代以來，指甲樣本中金屬、類金屬元素測(cè)定常用的檢測(cè)方法有原子熒光光譜法、原子吸收光譜法、中子活化法等，近年來電感耦合等離子體質(zhì)譜法因檢出限低、準(zhǔn)確度高、可同時(shí)測(cè)定多種元素等優(yōu)點(diǎn)，在生物樣品分析中應(yīng)用廣泛[4-5]。指甲樣本前處理方法多采用微波消解[6]、水浴消解[7]，對(duì)大批量樣本而言，石墨消解儀的環(huán)繞加熱方式可以使樣品受熱均勻，獨(dú)立消解罐密閉性好[8]，主箱和控制器為分體式，微機(jī)控制部可置于通風(fēng)柜外有效提升安全性，可同時(shí)處理60個(gè)以上的樣本，易于實(shí)現(xiàn)消解、趕酸等過程的自動(dòng)化[9]，因此在大樣本分析過程中備受研究人員青睞[10]。本文建立了指甲中14種元素的石墨消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定法，可用于快速評(píng)估人體對(duì)金屬、類金屬的環(huán)境暴露情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛科技有限公司)，Vulcan石墨消解儀(加拿大Questron有限公司)，TOLEDO ME-T分析天平(瑞士METTLER有限公司)，Milli-Q IX7003純水機(jī)(德國(guó)默克有限公司)，鼓風(fēng)干燥箱。

鉻、錳、鈷、鎳、砷、硒、鉬、鎘、錫、銻、鉈、鉛多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，美國(guó)Accustandard公司)，鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，美國(guó)Accustandard公司)，汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL，美國(guó)Accustandard公司)，鈧、鍺、鉍、镥、銠內(nèi)標(biāo)溶液(100 μg/mL，美國(guó)Accustandard公司)，硝酸(MOS級(jí)，日本多摩公司)，過氧化氫(25%，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán))，L-半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Sigma公司)，頭發(fā)質(zhì)控樣(GBW07601a，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局)。

1.2 儀器工作參數(shù)

iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀經(jīng)過調(diào)諧后的工作參數(shù)見表1。

表1 ICP-MS儀器工作參數(shù)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

13種金屬、類金屬標(biāo)準(zhǔn)系列：用2%的硝酸溶液將多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、鋅元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中鋅元素濃度為2 000 μg/L，其他12種元素濃度為100 μg/L。使用上述中間標(biāo)準(zhǔn)液配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列，其中鋅元素濃度為0、2.0、10、20、60、100、200、400、1 000、2 000 μg/L，其余12種元素濃度為0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L。

汞元素標(biāo)準(zhǔn)曲線：用含有L-半胱氨酸(1%)-硝酸(2%)的溶液作為汞元素的稀釋液。將10 μg/mL汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為10 μg/L的中間標(biāo)準(zhǔn)液，采用逐級(jí)稀釋法配制汞元素濃度為0、0.100、0.500、1.00、2.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：移取濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液適量，用硝酸溶液(2%)逐級(jí)稀釋為濃度為6 μg/L的內(nèi)標(biāo)使用溶液。

1.4 樣品前處理

將指甲樣品置于5 mL玻璃離心管中，加入丙酮浸沒樣品，浸泡清洗1 h后棄去丙酮浸泡液，加入超純水浸沒樣品，超聲清洗30 min，如此反復(fù)清洗3次，至樣品表面無油污、泥漬。將清洗后的指甲樣品于鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃烘干，至樣品干燥后取出待用。

準(zhǔn)確稱取干燥后的指甲樣品0.1 g(精確至0.000 1 g)于特氟龍消解罐中，加入2 mL濃硝酸、2 mL過氧化氫于石墨消解儀中。將消解罐置入消解架，啟動(dòng)程序升溫，30 min內(nèi)從室溫升至110 ℃，消解1 h至消解液透明或呈淡黃色。移除消解罐密封蓋，于110 ℃趕酸，待消解液剩余約0.5 mL時(shí)，將消解罐置于通風(fēng)櫥冷卻至室溫。將消解罐內(nèi)樣品轉(zhuǎn)移至50 mL離心管內(nèi)，超純水清洗并定容至50 mL，搖勻待用。樣品空白與質(zhì)控樣品同步處理。

1.5 樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

使用在線內(nèi)標(biāo)，在設(shè)定條件下測(cè)定樣品，測(cè)定序列為空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)溶液系列、質(zhì)控樣品和樣品。以被測(cè)元素響應(yīng)計(jì)數(shù)值(CPS)與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)計(jì)數(shù)值的比值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算被測(cè)溶液的濃度值。應(yīng)用Microsoft Excel 2016 對(duì)288份樣品濃度的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 消解液的配比對(duì)測(cè)定的影響

在處理大量樣品時(shí)為了提高前處理效率，縮短消解總時(shí)間，需增加消解液的氧化性?？疾? mL硝酸+3 mL過氧化氫、1.5 mL硝酸+2.5 mL過氧化氫、2 mL硝酸+2 mL過氧化氫、3 mL硝酸+1 mL過氧化氫的比例配制消解液，并對(duì)與指甲成分類似的頭發(fā)質(zhì)控樣品(GBW07601a)進(jìn)行消解。樣品在1 mL硝酸+3 mL過氧化氫的配比下因酸度過低無法完全消解，通過目測(cè)消解效果后發(fā)現(xiàn)仍留有大量未消解的頭發(fā)樣品，1.5 mL硝酸+2.5 mL過氧化氫可完全消解樣品，但對(duì)消解液上機(jī)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)僅有部分元素可達(dá)到參考值范圍，推測(cè)酸度仍然較低無法實(shí)現(xiàn)全部元素的完全消解，3 mL硝酸+1 mL過氧化氫的配比方式酸度過高導(dǎo)致樣品與消解液反應(yīng)劇烈迅速消耗全部消解液，故未能進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，綜合考察后確定了以2 mL硝酸+2 mL過氧化氫的比例配制消解液，在此配比條件下既可實(shí)現(xiàn)樣品的充分消解又滿足樣品測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。

表2 消解液的配比對(duì)測(cè)定的影響

2.2 消解時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響

為了考察不同的消解時(shí)間(45、60、75 min)對(duì)樣品消解實(shí)際情況的影響，以有參考值的頭發(fā)質(zhì)控樣品(GBW07601a)作為參考物質(zhì)在三個(gè)時(shí)間下充分消解后上機(jī)檢測(cè)，在45 min的消解時(shí)間內(nèi)樣品中的部分元素如鈷、鎳、砷、鉬、汞無法充分消解，測(cè)定值小于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)范圍值。而在75 min的消解時(shí)間內(nèi)樣品中鈷、砷、硒、錫、銻、鉈、汞元素因消解時(shí)間過長(zhǎng)易和硝酸發(fā)生反應(yīng)后生成硝酸化合物，故測(cè)定值均小于參考范圍。多次評(píng)估后樣品在60 min的時(shí)間下消解后上機(jī)測(cè)定所有元素均可達(dá)到參考值范圍的要求，故選擇60 min為消解樣品時(shí)間，結(jié)果見表3。

表3 消解時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響

2.3 趕酸溫度對(duì)測(cè)定的影響

選擇4個(gè)重點(diǎn)考察溫度(100、110、120、130 ℃)，使用有參考值的頭發(fā)質(zhì)控樣品(GBW07601a)作為參考物質(zhì)，樣品充分消解后，在4個(gè)溫度下進(jìn)行趕酸。樣品100 ℃的趕酸溫度下上機(jī)測(cè)定后部分元素如鈷、砷、鎘、錫、銻、鉈、鉛無法達(dá)到參考值范圍，推測(cè)可能消解溫度較低，趕酸效果不理想，導(dǎo)致消解液酸度過高，消解液基質(zhì)效應(yīng)過強(qiáng)等因素影響了測(cè)定值，而樣品在120和130 ℃的溫度下因趕酸溫度較高，消解液過度揮發(fā)導(dǎo)致部分元素?fù)p失，樣品上機(jī)后呈現(xiàn)小于參考值的趨勢(shì)，多次試驗(yàn)和評(píng)估后樣品在110 ℃的趕酸條件下所有待測(cè)元素均可滿足證書參考值要求，故選擇110 ℃為前處理方法的趕酸溫度，結(jié)果見表4。

表4 趕酸溫度對(duì)測(cè)定的影響

2.4 回歸方程、線性范圍和檢出限

鉻、錳、鈷、鎳、砷、硒、鉬、鎘、錫、銻、鉈、鉛等12種元素在0.1～100 μg/L、鋅在2.0～2 000 μg/L、汞在0.1～2.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r>0.999，連續(xù)測(cè)定樣品空白11次，以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)應(yīng)的濃度值計(jì)算方法檢出限和定量限。經(jīng)質(zhì)量換算14種元素方法檢出限和方法定量限分別在0.002～0.24 μg/g和0.01～0.81 μg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 14種元素的回歸方程、線性范圍和檢出限

2.5 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

收集志愿者指甲樣本，清洗干燥后研磨混勻，經(jīng)多次測(cè)定出穩(wěn)定值，作為模擬質(zhì)控樣品。取適量各測(cè)定3批，每批平行測(cè)定4次，分別加入高濃度(鋅元素1 500 μg/L、汞元素1.25 μg/L、其他元素75 μg/L)、中濃度(鋅元素500 μg/L、汞元素0.75 μg/L、其他元素25 μg/L)、低濃度(鋅元素25.0 μg/L、汞元素0.125 μg/L、其他元素1.25 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，指甲樣本中14種元素高、中、低三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率在80.8%～113%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表6。

表6 14種元素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

2.6 方法精密度實(shí)驗(yàn)

選擇不同濃度的指甲樣品，編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)，按同樣的前處理方式進(jìn)行消解得待測(cè)液，各測(cè)定3批，每批次測(cè)定3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣品重復(fù)測(cè)定4次，分別計(jì)算均值(x)以及批內(nèi)和批間的總變異數(shù)(CV)，考察方法精密度(表7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種不同濃度指甲樣品待測(cè)液中14種元素的批內(nèi)、批間和總變異系數(shù)分別在0.32%～5.3%、0.55%～6.3%和0.58%～6.7%，方法穩(wěn)定性良好。

表7 14種元素精密度結(jié)果

2.7 樣品的測(cè)定

應(yīng)用此方法對(duì)288份人體指甲樣品進(jìn)行測(cè)定，14種元素在指甲樣本中普遍存在，其中90%以上的樣品中可檢測(cè)出鉻、錳、鎳、鋅、硒、錫、鉛、汞8種元素，75%以上的樣品中可檢測(cè)出鈷、砷、鉬、鎘、銻3種元素，鉈元素含量較低僅有4.21%的樣品中可檢測(cè)出，具體見表8。

表8 指甲樣品中14種元素的暴露水平

2.8 質(zhì)量控制

大樣本分析過程中，實(shí)驗(yàn)空白、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性的控制是保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)從環(huán)境、水、試劑、材料等多方面對(duì)空白進(jìn)行控制，并同批次制備樣品空白，樣品分析過程中各批次實(shí)驗(yàn)空白均小于檢出限。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)對(duì)基質(zhì)類似的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。目前市面無人群指甲類質(zhì)控樣品，實(shí)驗(yàn)選擇與指甲組成成分類似的人體頭發(fā)質(zhì)控樣品作為參考，每批次樣本同步處理兩個(gè)頭發(fā)質(zhì)控樣品，測(cè)定結(jié)果基本符合證書給定范圍，平行樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在實(shí)驗(yàn)室控制范圍內(nèi)，具體數(shù)據(jù)見表9。上述質(zhì)控措施較好地保證了數(shù)據(jù)的分析質(zhì)量。

表9 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)頭發(fā)質(zhì)控樣中14種元素的測(cè)定結(jié)果

2.9 討論

指甲樣品可在不傷害志愿者的情況下獲得，樣品穩(wěn)定適合長(zhǎng)期存儲(chǔ)，與血液和尿液樣本相比，指甲樣本中殘留的金屬濃度也更高。其直接接觸和長(zhǎng)期積累金屬的能力，反映了被測(cè)者至少一年的暴露時(shí)間[11]。而清洗是指甲樣本分析測(cè)試的必要程序，以去除其表面的外源性元素而不改變內(nèi)源性元素含量。文獻(xiàn)調(diào)研表明有機(jī)溶劑、無機(jī)酸、洗潔精及水可用于指甲的清洗。金屬元素易與指甲角蛋白中的二硫基結(jié)合，研究表明，使用洗潔精清洗內(nèi)源性元素含量變化不大，而使用酸性溶液清洗則存在內(nèi)源性元素?fù)p失的風(fēng)險(xiǎn)。指甲樣本具有個(gè)體差異性，實(shí)驗(yàn)中大部分樣本可經(jīng)丙酮、水清洗干凈，對(duì)于少量難清洗的樣本可使用添加少量表面活性劑的洗潔精或其他清潔劑進(jìn)行清洗已達(dá)到清潔的目的。

因目前市面缺失有關(guān)指甲中多元素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法供參考，在前期搭建方法和對(duì)前處理?xiàng)l件的評(píng)估中采用的是與指甲成分相同[12]的頭發(fā)質(zhì)控樣品(GBW07601a)，同時(shí)也收集了志愿者的指甲混勻后檢測(cè)，后因?yàn)闊o法確保指甲樣品的均勻性和穩(wěn)定性，在評(píng)估前處理方法時(shí)參考數(shù)據(jù)還是選擇依據(jù)頭發(fā)質(zhì)控樣品。

汞元素有較強(qiáng)的吸附性，易于吸附在容量瓶、樣品管、進(jìn)樣系統(tǒng)上，形成記憶效應(yīng)從而影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別是低濃度時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響更不容忽視。文獻(xiàn)資料表明L-半胱氨酸可與汞形成絡(luò)合物[13-14]，從而有效降低或消除這一影響。實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)系列配制和樣品分析階段均加入L-半胱氨酸溶液，分別用1%的L-半胱氨酸水溶液配制汞標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和清洗液參與進(jìn)樣過程。此外，汞元素的檢測(cè)對(duì)器皿清潔度要求較高，在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下應(yīng)做到配制汞標(biāo)準(zhǔn)系列的器皿為獨(dú)立使用，避免接觸其他元素，檢測(cè)及盡可能在較短時(shí)間內(nèi)完成，也可在某種程度上減少記憶效應(yīng)對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。

3 結(jié)論

建立的指甲中14種元素的石墨消解-電感耦合等離子質(zhì)譜測(cè)定法，石墨消解法處理指甲、頭發(fā)等難以消解的樣品，其控溫精度良好，升溫迅速、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，大批量樣品處理過程安全可靠。14種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法靈敏度高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，對(duì)于人體指甲等生物樣本的快速檢測(cè)和評(píng)估人體重金屬暴露情況有著重要的參考意義。