吳會(huì)斌，姜凌娟

Clinimix E（克靈麥）中色氨酸雜質(zhì)M的測定

吳會(huì)斌1，姜凌娟2

（1. 遼寧海思科制藥有限公司，遼寧 興城 125100； 2. 遼寧海思科制藥有限公司沈陽分公司，遼寧 沈陽 110179）

目的：建立Clinimix E（克靈麥）中氨基酸注射液色氨酸雜質(zhì)M的測定方法。方法：采用HPLC法測定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鈉緩沖液（取磷酸二氫鈉約3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加2.9 g·L-1磷酸溶液1 000 mL，以磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3）-乙腈=88.5∶11.5為流動(dòng)相A，以磷酸二氫鈉緩沖液（pH2.3）-乙腈=65∶35為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫，流速為每分鐘0.7 mL；檢測波長為220 nm；柱溫為40 ℃。結(jié)果：在0.202 8～4.056 0μg·mL-1范圍內(nèi)，色氨酸雜質(zhì)M的濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好；該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度的 RSD 值分別為0%、0.2%。結(jié)論：該方法專屬性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度良好，可用于Clinimix E（克靈麥）中氨基酸腔袋色氨酸雜質(zhì)M的測定。

色氨酸雜質(zhì)M；HPLC法；氨基酸注射液

腸外營養(yǎng)（parenteral nutrition，PN）是從靜脈內(nèi)供給營養(yǎng)作為手術(shù)前后及危重患者的營養(yǎng)支持，包括熱量（碳水化合物、脂肪乳劑）、必需和非必需氨基酸、維生素、電解質(zhì)及微量元素。腸外營養(yǎng)目的是使病人在無法正常進(jìn)食的狀況下仍可以維持營養(yǎng)狀況、體重增加和創(chuàng)傷愈合，幼兒可以繼續(xù)生長、發(fā)育[1-6]。

Clinimix E（克靈麥）是專為腸外營養(yǎng)設(shè)計(jì)的即用型雙室袋產(chǎn)品，含5.5%氨基酸、10%的葡萄糖以及各種可溶性電解質(zhì)，為機(jī)體提供蛋白質(zhì)原料、碳水化合物熱卡及電解質(zhì)。Clinimix E（克靈麥）含15種左旋氨基酸，其中8種系人體必需氨基酸，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，用于合成蛋白質(zhì)和其他生物分子，或者氧化為尿素和二氧化碳提供能量。其中的色氨酸為不穩(wěn)定氨基酸，在高溫、氧化條件下易降解出多種雜質(zhì)，如犬尿氨酸、吲哚-3-甲醛、色氨酸雜質(zhì)B、D、M等[7-12]，通過對比美國藥典、歐洲藥典、英國藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[11-16]，本研究建立了一種高效液相色譜法檢測制劑中色氨酸雜質(zhì)M，為完善質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent）、PB-10 pH計(jì)（Sartorius）、SQP電子天平（Sartorius）、色氨酸雜質(zhì)M對照品（Sigma，批號：MKBK4239V）、磷酸二氫鈉、乙腈。

1.2 供試品

Clinimix E（克靈麥）氨基酸腔袋藥液（Baxter Healthcare Corporation，批號：P377481）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 操作步驟

精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，以10%乙腈稀釋至刻度，作為供試品溶液；取雜質(zhì)M對照品適量，精密稱定，以10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 μg的溶液，作為雜質(zhì)M對照品貯備液；精密量取對照品貯備液2 mL，置同一10 mL量瓶中，以10%乙腈稀釋至刻度，作為對照品溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2015年版四部通則0512）測定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸二氫鈉緩沖液（取磷酸二氫鈉約3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加2.9 g·L-1磷酸溶液1 000 mL，以磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3）-乙腈=88.5∶11.5為流動(dòng)相A，以磷酸二氫鈉緩沖液（pH2.3）-乙腈=65∶35為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫。流速為每分鐘0.7 mL；檢測波長為220 nm，柱溫40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 方法學(xué)考察

1.3.2.1 專屬性

采用酸、堿、氧化、高溫、光照等強(qiáng)烈破壞條件對供試品及陰性樣品進(jìn)行破壞，考察新增雜質(zhì)是否干擾雜質(zhì)M的檢測，同時(shí)取空白溶劑進(jìn)行對比考察。

1.3.2.2 線性

精密稱取雜質(zhì)M對照品適量，用10%乙腈溶解并稀釋制成不同濃度的對照品溶液，進(jìn)樣考察。

1.3.2.3 重復(fù)性

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品溶液和供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算6份供試品溶液中色氨酸雜質(zhì)M含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

1.3.2.4 溶液穩(wěn)定性

將雜質(zhì)M對照品溶液及供試品溶液置室溫條件下進(jìn)行放置，分別于不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，考察樣品溶液及對照品溶液的穩(wěn)定性。

1.3.2.5 準(zhǔn)確度

取雜質(zhì)M對照品適量，精密稱定，以10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 μg 的對照品溶液。取本品5 mL，9份，分別置10 mL量瓶中，分別加入對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL，制備3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度平行制備3份樣品。精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性

采用酸、堿、氧化、高溫、光照等強(qiáng)烈破壞條件對供試品及陰性樣品進(jìn)行破壞，產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與雜質(zhì)M分離度良好，不干擾雜質(zhì)M的測定；空白溶劑及陰性樣品均不干擾測定，表明該色譜條件專屬性良好。

2.2 線性

精密稱取雜質(zhì)M對照品適量，用10% 乙腈溶解并稀釋制成不同濃度的對照品溶液，進(jìn)樣考察。記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，色氨酸雜質(zhì)M濃度在0.202 8～4.056 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為=261.33-3.65，=0.999。色氨酸雜質(zhì)M線性標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 色氨酸雜質(zhì)M標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 重復(fù)性

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品溶液和供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算6份供試品溶液中色氨酸雜質(zhì)M含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為0，表明該方法重復(fù)性良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 溶液穩(wěn)定性

取對照品溶液分別于0、4、8、12、27 h取樣檢測；取供試品溶液分別于0、4、8、16、24 h取樣檢測，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積RSD，對照品溶液峰面積RSD為0.7%，供試品溶液峰面積RSD為2.0%。表明對照品溶液在27 h內(nèi)、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確度

取雜質(zhì)M對照品適量，精密稱定，以10%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 μg 的對照品溶液。取本品5 mL，9份，分別置10 mL量瓶中，分別加入對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL，制備3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度平行制備3份樣品。精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率平均值為99.1%，RSD為0.2%。表明該方法回收率高，滿足分析測定的要求?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了腸外營養(yǎng)制劑Clinimix E（克靈麥）中氨基酸注射液色氨酸雜質(zhì)M的測定方法。采用HPLC法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，磷酸鹽-乙腈緩沖系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在酸、堿、氧化、高溫及光照條件下破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對色氨酸雜質(zhì)M的測定均無干擾，方法專屬性好、線性范圍廣且重現(xiàn)性好，為Clinimix E（克靈麥）及同類復(fù)方氨基酸注射液中色氨酸雜質(zhì)M測定提供參考。

［1］沈娟．商品化多腔袋與個(gè)體化全合一腸外營養(yǎng)液臨床應(yīng)用比較［J］．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2020，37(1)：208-212．

［2］譚喜瑩，王超，姚義鵬，等．某中醫(yī)院腸外營養(yǎng)處方合理性分析與評價(jià)［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（29）：99-102．

［3］馮明華，王 霞，賴春華．危重癥早產(chǎn)兒胃腸外營養(yǎng)相關(guān)膽汁淤積的影響因素分析［J］． 中國臨床新醫(yī)學(xué)，2019，12（11）：1226-1229．

［4］徐安，章躍平，王鷹，等．腫瘤營養(yǎng)不良患者腸外營養(yǎng)治療中胰島素的實(shí)際營養(yǎng)支持作用觀察［J］．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2017，30（4）：331-333.

［5］周欣，李娟，楊佳丹，等．從營養(yǎng)支持病例實(shí)踐探討營養(yǎng)支持藥師在臨床營養(yǎng)支持中的作用［J］．中國藥學(xué)雜志，2019，54（4）：334-337．

［6］賀穎，梁宇紅，楊志杰，等. 腸外營養(yǎng)液處方分析及機(jī)構(gòu)知識(shí)庫建立研究進(jìn)展［J］.中國臨床新醫(yī)學(xué)2021，14（3）：325-328．

［7］劉悅，賈曼，崔婧，等. 超高效液相色譜一三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中3種色氨酸代謝物［J］．中國食物與營養(yǎng)2019，25(2)：37-40．

［8］郭雷,周長明,李輝,等．復(fù)方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)中焦谷氨酸雜質(zhì)的研究［J］．華西藥學(xué)雜志，2020，35(6)：668-671．

［9］謝紀(jì)珍，崔師睿，周沖, 等. 高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解產(chǎn)物［J］. 食品與藥品，2019，21（4）：298-303．

［10］FUKUWATARI T, SHIBATA K．Nutritional aspect of tryptophan metabolism［J］．, 2013, 6 (Suppl 1): 3-8．

［11］MARDONES O，DEVIA E，LABBE B S，et a1．Effect of L-trypto- phan and melatonin supplementation on the serotonin gastroin- testinal content and digestive enzymatic activity for Salmo satar and Oncorhynchus kisutch［J］．，2018，1 (1)：482-485．

［12］MIEHALOWSKA M，ZNORKO B，KAMINSKI T，et a1．New insights into tryptophan and its metabolites in the regulation of bone metabolism［J］．，2015，66 (6)：779-784．

［13］王靜，姜凌娟.脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的測定［J］. 遼寧化工，2021，50（06）：907-911.

［14］王棘，楊宏偉，潘雪妍. HPLC法測定復(fù)方氨基酸（15）雙鈦（2）注射液中3種雜質(zhì)含量［J］. 中國藥師，2013，16（1）：87-89.

［15］樓永明，林敏，陳秀琳. HPLC測定復(fù)方氨基酸注射液（18AA）有關(guān)物質(zhì)的初步研究［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2019，20（1）：37-41.

［16］國家藥典委員會(huì). 中國藥典2020年版（第二部）［M］. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2020: 479-480.

Determination of Tryptophan Impurity M Content in Clinimix E

1,2

（1. Liaoning Haisco Pharmaceutical Co., Ltd., Xingcheng Liaoning 125100, China;2. Liaoning Haisco Pharmaceutical Co., Ltd. Shenyang Branch, Shenyang Liaoning 110179, China）

A method for determination of tryptophan impurity M in amino acid injectionof Clinimix E. was established. HPLC was used to determine, octadecylsilane silica gel was used as filler, sodium dihydrogen phosphate buffer (pH=2.3)-acetonitrile(volume ratio 88.5∶11.5) was used as mobile phase A, sodium dihydrogen phosphate buffer (pH=2.3)-acetonitrile(volume ratio 65∶35) was used as mobile phase B, gradient elution was adopted, the flow rate was 0.7mL·min-1,the detection wavelength was 220 nm,the column temperature was 40 ℃. The results showed that, there was good linear relationship between the mass concentration of tryptophan impurity M and the peak area method at the range of 0.202 8～4.056 0 μg·mL-1.The RSD values for the repeatability and accuracy of the method were 0 and 0.2%, respectively. The method has good specificity, reproducibility and accuracy, and can be used for the determination of tryptophan impurity M content in Clinimix E.

Tryptophan impurity M; HPLC; Aminic acid injection

2021-12-31

吳會(huì)斌（1973-），男，遼寧省葫蘆島市人，工程師，1997年畢業(yè)于沈陽藥科大學(xué)藥物制劑專業(yè)，研究方向：藥品生產(chǎn)、質(zhì)量、研發(fā)。

TQ46

A

1004-0935（2022）06-0878-03