李家豪 謝芳 劉曉嵐

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)沙 410208；2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410006；3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410005）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）是常見(jiàn)的退行性骨關(guān)節(jié)病，其發(fā)病與年齡、肥胖、性別、體質(zhì)量以及外傷等多種因素有關(guān)[1～3]。OA 的病變常累及整個(gè)關(guān)節(jié)，如滑膜增生、骨贅形成、軟骨下骨硬化，而進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨破壞和細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝及分解代謝不平衡造成的軟骨流失是最主要的病理表現(xiàn)[4～5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在OA 發(fā)病人群中，膝骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis, KOA）發(fā)病率高達(dá)45%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他類型的 OA，故 KOA 是最主要的 OA 類型[6～7]。KOA 主要的臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬腫脹、關(guān)節(jié)周圍肌肉力量及功能下降[8～9]，是導(dǎo)致中老年人殘疾的主要原因之一[10]。有研究表明，KOA 影響著全球約2.5 億人的生活，每年帶來(lái)的醫(yī)療開(kāi)支超過(guò) 891 億美元[11～12]，可見(jiàn) KOA 不僅嚴(yán)重危害人類健康，還給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)。然而，由于KOA的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，到目前為止，臨床仍然缺乏治愈KOA 或完全阻止KOA 疾病發(fā)展的方法[13]。西醫(yī)從KOA 的病理特點(diǎn)出發(fā)，形成了以抗炎止痛、營(yíng)養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨及手術(shù)干預(yù)的系統(tǒng)治療方案，能在一定程度上緩解疼痛和改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，但也存在遠(yuǎn)期療效不佳、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及后遺癥等不足之處[14]。中醫(yī)治療KOA 有獨(dú)特的認(rèn)識(shí)，針對(duì)KOA 的發(fā)病特點(diǎn)及臨床癥狀表現(xiàn)形成了以補(bǔ)益肝腎、活血化瘀為代表的治療方法和理論體系。中醫(yī)藥治療KOA 臨床療效確切，在臨床中應(yīng)用廣泛，且患者的接受程度較高。

獨(dú)活與桑寄生是獨(dú)活寄生湯中的經(jīng)典藥對(duì)，廣泛應(yīng)用于肝腎不足型KOA 的治療。邵先舫教授以獨(dú)活寄生湯為基礎(chǔ)，結(jié)合自己臨床用藥經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的活膝湯在KOA 治療的臨床應(yīng)用中，療效優(yōu)良，其組方中也采用“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)，配伍以奏祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎之效，協(xié)同發(fā)揮治療KOA 的作用。由于天然藥物調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，“獨(dú)活與桑寄生”對(duì)KOA 的具體調(diào)控機(jī)制仍有待我們探索與研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)的理論基礎(chǔ)上，利用數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析生物系統(tǒng)和藥物分子的新型學(xué)科[15]。2007年，李梢提出生物網(wǎng)絡(luò)與中藥方劑兩者相結(jié)合的觀點(diǎn)[16]，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的日益發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)識(shí)別藥物中的化合物成分及靶點(diǎn)，能更準(zhǔn)確合理地指導(dǎo)藥物在臨床治療中使用。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為了一種可以系統(tǒng)、有效揭示中醫(yī)藥方劑中分子作用機(jī)制的方法[17]。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為依據(jù)，探討?yīng)毣钆c桑寄生的有效成分、潛在的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)獨(dú)活與桑寄生干預(yù)KOA 的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)防治KOA的進(jìn)一步研究提供依據(jù)和借鑒。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 工具與方法

1.1 藥對(duì)的活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索出獨(dú)活與桑寄生的藥物活性成分，篩選出類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18，且口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%的活性成分，同時(shí)查找得到相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。應(yīng)用Perl 插件刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)有效成分作用靶點(diǎn)。

1.2 KOA 作用靶點(diǎn)篩選 以“Knee Osteoarthritis”為檢索詞，在 GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，將條件設(shè)置為相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance Score）≥5 進(jìn)行篩選，在 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）中查找到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物與KOA 的交集靶點(diǎn)篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用R 軟件分析出藥物活性成分作用靶點(diǎn)與KOA 疾病靶點(diǎn)的交集，并以韋恩圖的方式呈現(xiàn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），蛋白種類的條件設(shè)置為“Homo Sapiens”，設(shè)置最低蛋白間互動(dòng)分?jǐn)?shù)的條件為0.7，構(gòu)建藥物活性成分-KOA 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction,PPI），可得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并基于 R 軟件計(jì)算出獲得交集靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻次。

1.4 藥物-成分-KOA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，制作出藥物-活性成分-KOA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表不同的有效成分或共同作用靶點(diǎn)，每條連線代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的相互關(guān)系。

1.5 Gene Ontology 富集分析和 KEGG Pathway 富集分析 在 Bioconductor 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.bioconductor.org/）中下載相關(guān)數(shù)據(jù)，應(yīng)用R 軟件對(duì)藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，應(yīng)用Perl 插件對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.6 分子對(duì)接 從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，應(yīng)用相應(yīng)軟件對(duì)靶點(diǎn)及活性成分進(jìn)行處理，然而導(dǎo)入AutoDockTools 中進(jìn)行分子對(duì)接，藥物分子與靶點(diǎn)的結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 則被認(rèn)為具有較好的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分與作用靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到獨(dú)活藥物活性成分99 種，篩選后得到9種有效成分。桑寄生藥物活性成分46 種，篩選后得到2 種有效成分。獨(dú)活活性成分作用靶點(diǎn)151個(gè)，桑寄生活性成分作用靶點(diǎn)93個(gè)。應(yīng)用Perl 插件篩選并剔除重復(fù)部分得到獨(dú)活與桑寄生有效成分作用靶點(diǎn)151個(gè)。其中編號(hào)為MOL004782 的分子尚未發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)?！蔼?dú)活-桑寄生”藥物有效成分與靶點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表1。

表1 獨(dú)活-桑寄生藥物有效成分與靶點(diǎn)數(shù)

2.2 KOA 作用靶點(diǎn)篩選 以“Knee Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥5 為篩選條件，在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到KOA 的疾病靶點(diǎn)共為2 261個(gè)。

2.3 藥物-活性成分-KOA 交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用R 軟件對(duì)比2 261個(gè)KOA 靶點(diǎn)與151個(gè)藥物有效成分作用靶點(diǎn)，篩選出94個(gè)共同作用靶點(diǎn)并畫出韋恩圖，得到的韋恩圖見(jiàn)圖1。采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建可視網(wǎng)絡(luò)圖，在藥物-有效成分-KOA 交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得96個(gè)節(jié)點(diǎn)和134 條邊。見(jiàn)圖2。藥對(duì)中各活性成分與KOA 疾病交集靶點(diǎn)的Degree 值見(jiàn)表2。

圖1 獨(dú)活-桑寄生活性成分靶點(diǎn)與KOA 疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 藥物-有效成分-KOA 交集靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)

表2 藥物活性成分與KOA 交集靶點(diǎn)的Degree 值

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖 在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入94個(gè)共同靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3。篩選出核心靶點(diǎn)，其中出現(xiàn)頻次較高的有 TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等。見(jiàn)圖 4。

圖3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）圖

圖4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)Degree 柱狀圖

2.5 GO 富集分析與KEGG 富集分析 對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子功能GO 富集分析，共得到2 064 條生物學(xué)功能條目，42 條細(xì)胞組成條目和122 條分子功能條目，各組分排名前10 的條目見(jiàn)圖5。對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 生物途徑富集分析，總共有148個(gè)不同生物途徑，排名前30 的生物途徑見(jiàn)圖6。其中排名前5 的包括：脂質(zhì)與粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路。“獨(dú)活-桑寄生”干預(yù)KOA 的主要信號(hào)通路見(jiàn)圖7。

圖5 共同靶點(diǎn)GO 功能分析氣泡圖

圖6 KEGG 富集分析氣泡圖

圖7 “獨(dú)活-桑寄生”干預(yù)KOA 的主要信號(hào)通路

2.6 分子對(duì)接 將篩選到的核心靶點(diǎn)和“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)中核心成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明該藥對(duì)的核心成分槲皮素可對(duì)核心靶點(diǎn)TNF、ILB 和AKT1 起作用，從而間接證實(shí)該藥對(duì)可通過(guò)調(diào)節(jié)TNF、ILB 和AKT1 靶點(diǎn)對(duì)KOA 起治療作用。見(jiàn)圖8。

圖8 “獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)核心靶點(diǎn)與KOA 的分子對(duì)接

3 討論

KOA 在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“骨痹病”范疇。其發(fā)病通常與風(fēng)寒濕邪侵襲、人體肝腎虧虛、瘀血阻絡(luò)有關(guān)?！端貑?wèn)·痹論篇》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹……骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎?！蓖瑫r(shí)《素問(wèn)·上古天真論》中曰：“七八肝氣衰，筋不能動(dòng)。八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。”可見(jiàn)，隨著年齡增加，肝腎虧虛，正體不足，邪毒就容易侵襲人體，從而發(fā)生痹病?！稄埵厢t(yī)通》：“膝者筋之府，膝痛無(wú)不因肝腎虧虛者，虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！薄蹲C治準(zhǔn)繩》亦云：“膝痛有風(fēng)，有寒，有閃挫，有瘀血，有痰積，皆實(shí)也，腎虛其本也”，肝腎虧虛是KOA 發(fā)生的主要內(nèi)因，風(fēng)寒濕邪侵襲人體為外因。同時(shí)，也有一些醫(yī)家認(rèn)為瘀血也是影響痹病的發(fā)病因素之一，《類證治裁·痹證》曰：“痹久必有瘀血”，《雜病源流犀燭》指出“痹者，閉也。三氣雜至，壅敝經(jīng)絡(luò)，血?dú)獠恍?，不能隨時(shí)祛散，故久而為痹。”王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中也提出“痹有瘀血”。由此可見(jiàn)本病肝腎虧虛是基礎(chǔ)，氣血瘀滯是關(guān)鍵，兼夾外感邪氣，屬于本虛標(biāo)實(shí)證，治療當(dāng)以補(bǔ)腎活血為主，輔以祛風(fēng)散寒除濕[18]。

獨(dú)活歸屬腎、膀胱經(jīng)，祛風(fēng)除濕、宣痹止痛；桑寄生歸屬肝、腎經(jīng)，補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨?！蔼?dú)活-桑寄生”常配伍用于補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕，是經(jīng)典方獨(dú)活寄生湯中的藥對(duì)。在KOA 治療的中藥用藥規(guī)律分析中發(fā)現(xiàn)，這兩味藥在治療KOA 的臨床組方中應(yīng)用較為廣泛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明獨(dú)活乙醇提取物能夠抑制環(huán)氧化酶-1 及環(huán)氧化酶-2，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果[19]。桑寄生具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用，其祛風(fēng)濕的作用可能與免疫抑制有關(guān)[20]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)干預(yù)KOA 的作用機(jī)制作了初步的數(shù)據(jù)挖掘。研究結(jié)果顯示“獨(dú)活-桑寄生”有效成分11 種，藥物有效成分已知的作用靶點(diǎn)151個(gè)，其中干預(yù)KOA 的潛在靶點(diǎn) 94個(gè)。最受關(guān)注的是槲皮素（quercetin，MOL000098），作用靶點(diǎn)多達(dá) 148個(gè)，其中與 KOA 相關(guān)的靶點(diǎn)多達(dá)88個(gè)。研究表明，槲皮素是一類雙黃酮類化合物，具有多種藥理作用，包括抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗病毒、抗癌、抗菌、抗炎、保肝、抗肥胖等[21～22]。在OA 的發(fā)展過(guò)程中，槲皮素能降低TNF-α、MMP3、MMP9、CCL2 的表達(dá)，在抗炎的同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[23]。湯喜蘭等[24]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)TNF-α、IL-6、IL-1β 的負(fù)性調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活完成?？梢?jiàn)，槲皮素可能是“獨(dú)活-桑寄生”作用于KOA 的關(guān)鍵活性成分之一。同時(shí)，β-谷甾醇和谷甾醇也具有抗炎、抗氧化等作用，其對(duì)KOA 的治療作用也屢見(jiàn)報(bào)道。

“獨(dú)活-桑寄生”與KOA 共同作用靶點(diǎn)PPI 映射及分析得到出現(xiàn)頻次較多的靶點(diǎn)，如TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等，這些可能是“獨(dú)活 -桑寄生”治療KOA 的潛在作用靶點(diǎn)。TNF 是一種常見(jiàn)的炎性細(xì)胞因子，在KOA 發(fā)病中有重要作用，中老年患者KOA 越嚴(yán)重則關(guān)節(jié)液中TNF-α 的含量水平越高[25]，通過(guò)降低關(guān)節(jié)中TNF-α 的含量能減輕關(guān)節(jié)炎癥，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，從而延緩KOA 的病情進(jìn)展[26]。同時(shí)，IL-1β 屬于白細(xì)胞介素分子家族，主要與炎癥反應(yīng)有關(guān)，下調(diào)IL-1β 表達(dá)能有效抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)[27～28]。MMP9 屬于金屬基質(zhì)蛋白酶家族，主導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，常常與IL6、TNF-α 等致炎因子協(xié)同促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞[29]。此外，AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究顯示AKT1 與細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制AKT1 的表達(dá)能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡[30～31]。

GO 富集分析與KEGG 富集分析結(jié)果顯示，上述共同作用靶點(diǎn)參與的生物活動(dòng)主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)等，并大多富集于脂質(zhì)與粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路。 晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycosylation End Products, AGE） 及 其 受 體（Receptor of AGE,RAGE）的作用機(jī)制尚未完全明確。目前研究顯示AGE 主要在糖尿病患者體內(nèi)高表達(dá)[32]，AGE-RAGE 能激活下游 NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn) IL-6、IL-8、TNF-α 等致炎因子的表達(dá)，激活的NF-κB 又能增加RAGE 的表達(dá)，形成正向的反饋調(diào)節(jié)[33]。除此之外，AGE-RAGE 還與 VEGF 的表達(dá)正相關(guān)，阻斷AGE-RAGE 的激活能抑制VEGF 的表達(dá)[34]。目前關(guān)于AGE-RAGE 信號(hào)通路的研究主要集中在糖尿病及心血管疾病方面，涉及OA 的研究較少。本研究KEGG 富集結(jié)果提示“獨(dú)活-桑寄生”干預(yù)KOA 的作用靶點(diǎn)與AGE-RAGE 信號(hào)通路高度相關(guān)，這為研究KOA 的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。而IL-17 和TNF 信號(hào)通路與KOA 的發(fā)病及病情進(jìn)展密切相關(guān)，分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)中槲皮素能調(diào)節(jié) ILB、TNF 和 AKT1 對(duì) KOA 起治療作用，間接證實(shí)了該藥對(duì)具有調(diào)節(jié)ILB、TNF 和AKT1 靶點(diǎn)治療KOA 的潛在作用，但該分子機(jī)制仍需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，“獨(dú)活-桑寄生”中11個(gè)有效成分，調(diào)控 IL6、TNF、AKT1 等 94個(gè)靶點(diǎn)，主要通過(guò)AGE-RAGE、TNF 和ILB 等信號(hào)通路干預(yù)KOA。本研究采用中藥藥理學(xué)分析，預(yù)測(cè)出“獨(dú)活-桑寄生”藥對(duì)治療KOA 的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究該藥治療KOA 的分子機(jī)制提供依據(jù)。同時(shí)，有利于進(jìn)一步明確中藥復(fù)雜成分的主要活性成分及作用機(jī)理，為該藥對(duì)在KOA 的臨床治療中應(yīng)用提供證據(jù)。