馬媛 李穎 馬海蘭

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一,尤其在發(fā)展中國家每年發(fā)病率呈上升態(tài)勢,是危害女性生命健康最常見的惡性腫瘤之一,死亡率較高。宮頸癌的病情發(fā)展過程較隱匿,宮頸癌出現(xiàn)相關(guān)癥狀時(shí)不能引起足夠重視,宮頸癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。宮頸癌的誘發(fā)病因復(fù)雜多樣,如性生活泛濫、過早生育及某些病毒如人皰疹病毒、HPV 感染等［1,2］。宮頸癌因女性生殖器官病變所致,給女性的生活帶來不便,對心理與身體造成嚴(yán)重傷害。臨床上宮頸癌若及早發(fā)現(xiàn)及治療可完全治愈。目前篩選有效治療措施尚待完善,惡性度高,快速發(fā)展且發(fā)病隱匿性高,就診不及時(shí)患者機(jī)體癌細(xì)胞已發(fā)展至晚期階段,尤其在婦科惡性腫瘤疾病中具有高死亡率。宮頸癌前病變發(fā)展為臨床宮頸癌多數(shù)歷經(jīng)數(shù)年甚長達(dá)幾十年的時(shí)間。早期宮頸癌臨床癥狀不明顯,該病發(fā)展至中晚期惡性度高。尋找一種簡單易行的分子生物學(xué)篩查標(biāo)記物有助于臨床診療,對延長宮頸癌患者生存時(shí)間具有必要性。研究報(bào)道,宮頸癌變過程涉及到多基因及表觀與調(diào)控基因變化,以 DNA 甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)變化為主,該過程表現(xiàn)出腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域有異常,使目的基因與調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄過程中已失活,明顯促進(jìn)腫瘤發(fā)展,一半以上的宮頸癌組織及細(xì)胞存在DNA 甲基化［3］。因此,在宮頸脫落細(xì)胞、宮頸組織活檢時(shí)基因甲基化為一項(xiàng)主要參考指標(biāo),有助于宮頸癌的早期階段診斷。隨著診斷技術(shù)發(fā)展及細(xì)胞學(xué)檢查等技術(shù)的推廣,HPV 病毒微量提取已廣泛被應(yīng)用,可有效診治多種類型宮頸癌前病變及早期浸潤宮頸癌［4］。本文研究的PCR 技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)能有效定量分析出正常宮頸、低級別病變宮頸、高級別病變宮頸、癌宮頸細(xì)胞、組織刮片PAX1 基因的甲基化水平,定量檢測出目的基因甲基化水平,臨床能明確區(qū)分各級宮頸病變。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年5 月～2020 年5 月在本院就診的高危型HPV 感染者100 例為研究對象,依據(jù)病理分級不同及FIGO 對宮頸癌的臨床分期準(zhǔn)則分為正常宮頸組(25 例)、低級別病變組(30 例)、高級別病變組(35 例)及癌變組(浸潤性宮頸癌,10 例)。正常宮頸組平均年齡(35.6±4.4)歲；低級別病變組平均年齡(38.5±5.4)歲；高級別病變組平均年齡(37.7±4.6)歲；癌變組平均年齡(37.2±2.5)歲。四組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。排除婦科良性腫瘤史、惡性腫瘤史、妊娠、免疫、造血系統(tǒng)病等相關(guān)病史患者。納入患者均符合宮頸病變的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)院倫理委員會審批及簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 宮頸標(biāo)本采集 患者取截石位,以常規(guī)消毒、鋪巾,取出宮頸病變部位細(xì)胞制備宮頸刮片,進(jìn)一步用陰道鏡鉗取出少量的宮頸組織進(jìn)行病理活檢,經(jīng)HPV檢查,保存于4℃以下。宮頸組織活檢后收集宮頸刮片測定PAX1 基因甲基化水平。各組檢測結(jié)果參照病理學(xué)檢查結(jié)果。

1.2.2 宮頸DNA 提取、化學(xué)修飾與擴(kuò)增 分別提取出宮頸DNA 經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后安排進(jìn)行 PAX1基因轉(zhuǎn)錄(參照德國 Q iagen 公司生產(chǎn)試劑盒說明書),PAX1 基因外側(cè)上游引物、外側(cè)下游引物：5’-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGG-3’、5’-ACCCAGC TCATCCACACTCCC-3’。PAX1 基因上游引物、下游引物：5’-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3’、5’-AAA TACCCRAGACTAAACGC-3’。用生物素標(biāo)記下游引物5’末端。

1.2.3 焦磷酸DNA測序 參照焦磷酸測序儀(美國,PyroMarkQ96ID 焦磷酸測序儀)甲基化要求,制備出單鏈DNA 模板再進(jìn)行焦磷酸測序。目的基因用引物(5'-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3’) 測PAX1 基 因9 個(gè) 胞嘧啶、磷酸、鳥嘌呤。獲得 PAX1 基因測序結(jié)果以單基因?qū)z測位點(diǎn)甲基化率值表示各樣本基因甲基化水平。經(jīng)焦磷酸測序術(shù)對相關(guān)目的基因 9 個(gè)不同位點(diǎn)甲基化定量分析。以試劑盒提供通DNA 內(nèi)參。不同位點(diǎn)檢測標(biāo)本中某單一位點(diǎn)甲基化水平與內(nèi)參中該位點(diǎn)甲基化水平比值示該位點(diǎn)甲基化發(fā)生率。

1.3 觀察指標(biāo) 對比四組病變組織中HPV 陽性率與PAX1 基因甲基化發(fā)生率；對比四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組病變組織中HPV 陽性率與PAX1 基因甲基化發(fā)生率對比 四組病變組織中HPV 陽性率與PAX1 基因甲基化發(fā)生率對比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 四組病變組織中HPV 陽性率與PAX1 基因甲基化發(fā)生率對比［n(%)］

2.2 四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平對比 四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平對比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。癌變組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平均明顯高于正常宮頸組、低級別病變組、高級別病變組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平對比(,%)

表2 四組宮頸刮片和宮頸組織中PAX1 基因甲基化水平對比(,%)

注：四組對比,P<0.05

3 討論

目前臨床上宮頸癌發(fā)病率、死亡率呈大幅上升趨勢,在女性惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率居首。HPV 的持續(xù)性、反復(fù)性感染為宮頸癌最常見病因之一。PAX1基因異常甲基化表達(dá)程度升高,大大影響了多個(gè)不同階段宮頸癌及癌前病變病理進(jìn)程,與宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展關(guān)聯(lián)性較高。近來發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中PAX1 基因的甲基化水平存在異常升高現(xiàn)象［5-7］。PAX1 未來可能作為早期階段宮頸癌診斷一個(gè)分子標(biāo)志物。傳統(tǒng)抑癌基因的甲基化檢測專于浸潤癌診斷領(lǐng)域,而對宮頸癌前病變?nèi)绺呒墑e宮頸癌前病變分子診斷極少［8］。抑癌基因異常甲基化可抑制抑癌基因的表達(dá)與下游基因的調(diào)控。宮頸癌組織中PAX1 基因甲基化水平異常增加與啟動子甲基化有關(guān),且在宮頸癌患者的脫落細(xì)胞中PAX1 基因甲基化被檢測,PAX1 基因甲基化陽性率與宮頸癌的病理分級與淋巴轉(zhuǎn)移等存在一定相關(guān)性［9］,因此 PAX1 基因可能為宮頸癌早期診療的一個(gè)分子標(biāo)志物。

綜上所述,在一定程度上PAX1 基因甲基化發(fā)生率及其定量水平可篩選宮頸癌高危人群,PAX1 基因甲基化定量檢測為敏感且特異性強(qiáng)的定量分析方法,可以為臨床檢測提供可靠依據(jù)。