郭金菊 史亮亮 王茹芳 曹海順 譚德龍 趙俊宏 張長遠(yuǎn)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣東 廣州 510640)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是重要的嶺南特色瓜類蔬菜，主要以膨大中后期綠果為食用器官，藥膳兼用，不僅營養(yǎng)豐富，還具有降糖、降脂、抗癌、防衰老等功能[1]，深受廣大消費(fèi)者喜愛，具有較高的經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值。

苦瓜屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，商品果采后3～5 d會逐漸變黃、軟化甚至腐爛，嚴(yán)重影響其商品品質(zhì)和貨架期，從而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。果實(shí)的成熟是一個復(fù)雜而精密的調(diào)控過程，受基因調(diào)控、激素調(diào)節(jié)以及溫度、光照等各種因素影響[3-4]。目前人們?nèi)晕茨芡耆沂酒湔{(diào)控機(jī)制，而對苦瓜果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)制研究更是鮮有報(bào)道。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的、數(shù)量眾多的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答、激素調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程[5]。近年來，有許多關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果實(shí)成熟的報(bào)道。例如，在番茄果實(shí)成熟調(diào)控通路中，NOR[6]、SlNAC1[7]和SlNAC4[8]等NAC轉(zhuǎn)錄因子是位于乙烯信號上游的調(diào)控果實(shí)成熟關(guān)鍵因子[9]；番茄nor自然突變體由于NOR基因第3個外顯子區(qū)域缺失2個連續(xù)的堿基導(dǎo)致移碼突變，造成NOR蛋白翻譯提前終止，最終抑制果實(shí)成熟[10]；SlNAC1為果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，依賴乙烯和ABA信號途徑影響果實(shí)成熟[7]；SlNAC4為果實(shí)成熟的正調(diào)控因子，SlNAC4基因下調(diào)會延遲果實(shí)成熟，顯著抑制乙烯合成、葉綠素降解以及類胡蘿卜素積累[8,11]。但由于NAC轉(zhuǎn)錄因子的種類和功能的多樣性，其調(diào)控果實(shí)成熟的分子機(jī)制仍有待研究。其中NAC轉(zhuǎn)錄因子McRPF為本研究前期篩選到的苦瓜果實(shí)成熟關(guān)鍵因子，但對其調(diào)控果實(shí)成熟的分子機(jī)制尚不清楚。利用酵母雙雜交等技術(shù)篩選McRPF的互作蛋白，對闡明McRPF調(diào)控苦瓜果實(shí)成熟的分子機(jī)制具有重要意義。鑒于此，本研究構(gòu)建苦瓜果肉組織酵母雙雜交cDNA文庫，并利用該文庫初步篩選到12個可能與McRPF互作的蛋白，以期為進(jìn)一步研究McRPF調(diào)控果實(shí)成熟的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 以苦瓜自交系E12201-e1為材料，于2021年3月種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地，常規(guī)管理，在盛花期對開花當(dāng)天子房(幼果)進(jìn)行掛牌標(biāo)記。采集處于綠熟期(18 days after pollination, DPA)、破色期(20 DPA)、轉(zhuǎn)色期(22 DPA)和完熟期(24 DPA)4個不同成熟階段的苦瓜果肉組織，液氮速凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Oligotex mRNA Kits、高純度質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Superscript?Double-Stranded cDNA Kit、UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl∶Alcohol(25∶24∶1, v/v/v)購自美國Invitrogen公司；Trimmer-2 cDNA normalization kit購自俄羅斯Evrogen公司；FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Sfi I限制性內(nèi)切酶購自立陶宛Fermentas公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；DNA Ligation Kit購自日本TOYOBO公司；酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；酵母缺陷型培養(yǎng)基購自美國Clontech公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與mRNA分離提純 取不同成熟期苦瓜果肉組織等量混合，利用Trizol法提取總RNA，使用Oligotex mRNA Kits分離純化樣本mRNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測目的片段的完整性與片段長度，用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建 按照Superscript?Double-Stranded cDNA Kit試劑盒說明書，將純化后的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈cDNA，加5′接頭(3個讀碼框，每個讀碼框連接一份，共3份)，并進(jìn)行均一化處理。使用1%濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠，電泳cDNA產(chǎn)物，切膠回收1 000 bp以上的目的片段。采用同源重組方式，使用All direct重組酶將上述cDNA分別與經(jīng)酶切處理線性化的pGADT7載體連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。取轉(zhuǎn)化后原液10 μL稀釋1 000倍后，從中吸取10 μL涂布于LB平板(含氨芐青霉素)，進(jìn)行庫容鑒定。挑取平板上的單克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測cDNA文庫片段長度及重組率。庫容(colony-forming units, CFU)鑒定公式如下：

庫容量(CFU·mL-1)=平板上的克隆數(shù)/10 μL×1000倍×1×103μL

(1)

文庫總CFU=文庫滴度(CFU·mL-1)×文庫菌液總體積(mL)

(2)

陽性率計(jì)算公式如下：

陽性率=重組成功數(shù)量/克隆總數(shù)×100%

(3)

將上述步驟驗(yàn)證合格(文庫庫容量>1×107CFU，平均插入片段>1 200 bp，陽性率>95%)的酵母雙雜交文庫，采用鋪板培養(yǎng)方式，涂布于25 cm的平板，每板涂布3萬個左右克隆子，于37℃過夜培養(yǎng)，第2天使用LB培養(yǎng)基洗脫克隆，利用高純度質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.2.3 pGBKT7-McRPF誘餌載體構(gòu)建 在McRPF基因的cDNA序列兩端添加Sfi I的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。將擴(kuò)增的目的片段和誘餌載體pGBKT7分別利用Sfi I內(nèi)切酶(Fermentas)進(jìn)行雙酶切，連接后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)。對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：Premix Taq 10 μL，20 μmol·L-1McRPF-F和McRPF-R引物各1 μL，ddH2O 8 μL，挑取菌落為模板；反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min， 30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對菌落進(jìn)行測序，獲得陽性克隆，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。設(shè)計(jì)的引物序列如下：

McRPF-F：5′-A A G G C C A T T A C G G C C A T G G G T C T A C G A G A C A T C G GA-3′McRPF-R：5′-C C G G C C G A G G C G G C C T C A A G C A A C A A A A T A G T C A A A A TG-3′

1.2.4 誘餌蛋白自激活檢測 參照MatchmakerTM GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries(Clontech)試驗(yàn)方法，將表1組合分別轉(zhuǎn)化到AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞中。每個轉(zhuǎn)化用200 μL無菌水懸浮菌體，溫和混勻，涂布于二缺培養(yǎng)基(SD/-Leu-Trp)，30℃恒溫培養(yǎng) 4 d， 觀察生長狀況。從pGADT7與pGBKT7-McRPF共轉(zhuǎn)化AH109長出的酵母轉(zhuǎn)化子中，隨機(jī)挑取6個菌落點(diǎn)板至四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu-Trp-His-Ade)，30℃恒溫培養(yǎng)4 d，觀察其生長狀況。

表1 不同重組質(zhì)粒組合Table 1 Different combinations of recombinant plasmids

1.2.5 McRPF互作蛋白篩選 用含有正確pGBKT7-McRPF誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將pGADT7文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中，按照1∶10、1∶100和1∶1 000分別涂布于SD-Trp-Leu-His+5 mmol·L-13AT平板，30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，記錄轉(zhuǎn)化效率。為了消除背景生長菌落的干擾，在培養(yǎng)至第3天時(shí)，用無菌絨布對篩庫平板進(jìn)行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d。至影印清除后繼續(xù)培養(yǎng)7 d，從篩庫平板中挑取長出的陽性克隆單菌落，轉(zhuǎn)接至 SD/-Leu-Trp 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。將上述SD/-Leu-Trp培養(yǎng)基上長出的初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種至SD/-Leu-Trp + X-α-Gal和SD/-Leu-Trp-His-Ade 培養(yǎng)基上進(jìn)行HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因檢測，30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。

將以上陽性克隆菌株分別接入SD/-Leu-Trp液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜后抽提酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。將含有陽性克隆的Top10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序和BLAST比對。

將陽性克隆回轉(zhuǎn)至含有pGBKT7-McRPF誘餌質(zhì)粒的AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Leu-Trp培養(yǎng)基。再將上述SD-TL缺陷型平板上長出的轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種至SD/-Leu-Trp和 SD/-Leu-Trp-His-Ade+X-α-Gal 培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與mRNA分離純化

將處于不同成熟期的苦瓜果肉組織等量混合，提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1-A)表明，RNA主帶清晰，完整性好，無降解，可用于cDNA文庫構(gòu)建。使用Oligotex mRNA Kits試劑盒分離純化樣本mRNA。獲得mRNA總量為3.2 μg，電泳檢測結(jié)果(圖1-B)顯示，mRNA條帶清晰，呈1條均勻集中的彌散條帶，質(zhì)量完好，無降解，滿足建庫需要。

注：A：總RNA電泳圖；M為5 kb DNA marker； B：mRNA電泳圖。Note: A: The agarose gel electrophoresis of total RNA. M: 5 kb plus DNA marker. B: The agarose gel electrophoresis of mRNA.圖1 苦瓜果肉組織RNA電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis analysis of RNA extracted from bitter gourd flesh tissue

注：M：1 kb plus DNA marker。1～24: PCR產(chǎn)物。Note: M: 1kb plus DNA marker. 1～24: PCR products.圖2 cDNA文庫插入片段和重組率檢測結(jié)果Fig.2 Identification of insertion fragment size and recombination rate of cDNA library

2.2 cDNA文庫構(gòu)建與質(zhì)量鑒定

取10 μL原始電轉(zhuǎn)化菌液稀釋1 000倍后，取10 μL涂布于LB平板(含氨芐青霉素)，共長出約250個克隆子，計(jì)算得到文庫庫容量約為1.25×107CFU。為檢測文庫重組序列的完整性，隨機(jī)挑取24個克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。由圖2可知，插入片段主要分布在800～2 000 bp，且平均長度大于1 200 bp，陽性率為100%，文庫質(zhì)量較高，符合篩庫標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 誘餌載體構(gòu)建與自激活檢測

以苦瓜果肉組織cDNA為模板，利用高保真酶FastPfu DNA Polymerase擴(kuò)增McRPF的編碼區(qū)序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，目的條帶大小約為500 bp，與預(yù)期片段大小一致(圖3-A)。將回收后的目的條帶與pGBKT7用Sfi I進(jìn)行酶切，用T4-DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)，并進(jìn)行菌落PCR(圖3-B)和測序鑒定，PCR擴(kuò)增條帶與目的條帶大小一致，且測序序列與目的擴(kuò)增序列一致，表明成功構(gòu)建了pGBKT7-McRPF誘餌載體。

注：A：1～2：McRPF擴(kuò)增產(chǎn)物；B：1～6：陽性克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。M：DL5000 DNA marker。Note: 1～2: A: Amplified products of McRPF. B: 1～6: Identification of the positive clones by PCR. M：DL5000 DNA marker.圖3 誘餌載體構(gòu)建與菌落PCR鑒定Fig.3 Construction and identification of bait recombinant vector

將pGADT7/pGBKT7-McRPF、pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53(陽性對照)、pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC(陰性對照)分別轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu-Trp平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。長出的酵母轉(zhuǎn)化子中，隨機(jī)挑取6個菌落接種至SD/-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，3組菌株在SD/-Leu-Trp平板培養(yǎng)基上均能正常生長，僅有陽性對照可在SD/-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上生長(圖4)，說明該誘餌蛋白無自激活活性，可進(jìn)行篩庫試驗(yàn)。

圖4 誘餌載體pGBKT7-McRPF的自激活檢測Fig.4 Self-activation detection of the bait vector pGBKT7-McRPF

2.4 McRPF互作蛋白篩選

將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有誘餌質(zhì)粒的感受態(tài)中，按3種濃度稀釋，涂布平板，分別獲得712、94和14個克隆，文庫轉(zhuǎn)化效率為1.62×104μg-1(圖5-A)。挑取陽性克隆單菌落分別接種至SD/-Leu-Trp+X-α-Gal和SD/-Leu-Trp-His-Ade缺陷平板上，共獲得29個初始陽性克隆，且均能同時(shí)激活HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因(圖5-B)。將篩選到的29個陽性克隆進(jìn)行DNA測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析，初步獲得13個不同的蛋白編碼基因(表2)。將這13種陽性克隆與McRPF誘餌克隆共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證檢測，結(jié)果顯示有12個陽性克隆能激活HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因(圖5-C)。

注：A：文庫轉(zhuǎn)化效率鑒定；B：文庫篩選獲得的陽性克隆，其中“+”為陽性對照，“-”為陰性對照；C: 候選互作蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。Note: A: Library transformation efficiency identification. B: Positive clones obtained by library screening, ‘+’ is the positive control, ‘-’ is the negative control. C: Retest of candidate interacting proteins.圖5 cDNA文庫篩選結(jié)果Fig.5 Results of cDNA libary screening

表2 McRPF互作蛋白比對結(jié)果Table 2 Blast results of McRPF interacting proteins

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種便捷、有效的方法，而高質(zhì)量cDNA文庫的構(gòu)建是利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選互作蛋白的重要前提[12-13]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，目前已經(jīng)獲得了很多物種的酵母雙雜交cDNA文庫，并在此基礎(chǔ)上篩選獲得目標(biāo)蛋白的互作蛋白[14-18]?？喙蠟閹X南特色瓜類蔬菜作物，基礎(chǔ)研究起步較晚，截至目前鮮有關(guān)于苦瓜酵母雙雜交文庫的相關(guān)報(bào)道。本研究利用All-Direct技術(shù)，通過同源重組方法建立了苦瓜不同成熟期果肉組織cDNA文庫，文庫庫容為1.25×107CFU，插入片段平均長度大于1 200 bp，陽性率為100%。評價(jià)cDNA文庫質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)主要是文庫庫容、空載率和插入片段平均長度[10,14]。本研究構(gòu)建的文庫質(zhì)量達(dá)到了酵母篩選文庫標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步開展互作蛋白篩選和新基因的挖掘工作奠定了基礎(chǔ)。

果實(shí)成熟是高度協(xié)調(diào)、復(fù)雜的生物學(xué)過程，受自身基因和外界環(huán)境條件等各種因素影響，涉及色澤、質(zhì)地等外部形態(tài)變化，以及細(xì)胞壁降解、糖類、有機(jī)酸和芳香化合物代謝等內(nèi)在生理生化變化[3-4]。近年來，通過對番茄、擬南芥和水稻等模式植物的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控在果實(shí)成熟過程中發(fā)揮著重要作用，并相繼從番茄[19]、獼猴[20]、香蕉[21]等果實(shí)中分離鑒定出EIN3/EIL、AP2/ERF、MADS-box、NAC、WRKY等許多與果實(shí)成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。本研究利用構(gòu)建的酵母雙雜交文庫，對苦瓜果實(shí)成熟關(guān)鍵因子McRPF的互作蛋白進(jìn)行篩選，初步篩選獲得13個可能與McRPF互作的蛋白，并通過回轉(zhuǎn)驗(yàn)證最終獲得12個候選靶標(biāo)蛋白。通過基因功能注釋和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)12個候選靶標(biāo)蛋白涉及多種生物學(xué)過程，例如，WRKY31可能參與各種生物和非生物脅迫應(yīng)答[22]、糖代謝[23]、果實(shí)的成熟衰老[21,24]等；蛋白酶Do-like 1(Protease Do-like 1，DEG1)參與光系統(tǒng)Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)復(fù)合物反應(yīng)中心D1蛋白的降解，從而在PSⅡ復(fù)合物的修復(fù)循環(huán)和功能維護(hù)中發(fā)揮重要作用[25]；異黃酮還原酶(isoflavone reductase, IFR)是異黃酮分解途徑的關(guān)鍵酶之一，在調(diào)控異黃酮含量及成分方面發(fā)揮著重要作用[26]；泛素NEDD8-like蛋白Rub1是最重要的類泛素化蛋白之一，被鑒定為細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[27]；精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase, ADC)是多胺合成途徑中的關(guān)鍵酶，能通過調(diào)節(jié)活性氧的積累增強(qiáng)植物的對逆境脅迫的耐受能力[28-30]。E3泛素連接酶RGLG2(E3 ubiquitin-protein ligase RGLG2)是蛋白質(zhì)泛素化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，廣泛參與植物生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動，如擬南芥RGLG1和RGLG2與AtERF53相互作用負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的旱脅迫響應(yīng)[31-33]。由此推測MCRPF通過與WRKY31互作調(diào)控苦瓜果實(shí)的成熟，為進(jìn)一步揭示McRPF調(diào)控苦瓜果實(shí)成熟的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了不同成熟期苦瓜果肉組織酵母雙雜交文庫，該文庫庫容為1.25×107CFU，平均插入片段大于1 200 bp，陽性率為100%，文庫質(zhì)量較高，為果實(shí)成熟相關(guān)基因篩選提供了資源。此外，利用該文庫篩選獲得12個與苦瓜果實(shí)成熟關(guān)鍵調(diào)控蛋白McRPF互作的蛋白，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)12個候選靶標(biāo)蛋白涉及光系統(tǒng)修復(fù)、異黃酮分解、植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)等多種生物學(xué)過程，為深入解析McRPF調(diào)控苦瓜果實(shí)成熟的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。