陳維楊，郝躍東，王守國，季峰

長期或持續(xù)使用地塞米松（dexamethasone,Dex）可對人成骨細胞產生直接的細胞毒性，是人類骨質疏松甚至骨壞死的主要因素之一，了解Dex誘導成骨細胞損傷的病理機制有助于制定新的干預策略[1-4]。早期研究表明，激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）級聯反應可以使細胞在應激條件下存活[5]。AMPK誘導的細胞保護機制不同，活化的AMPK能夠通過抑制消耗并促進合成來增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）的含量，從而保護人體細胞免受氧化損傷[6]。此外，AMPK 可以激活其下游核因子E2 相關因子2（NFE2-related factor 2,Nrf2）在不同細胞中的級聯反應，并抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的積累和氧化損傷[4,7-9]。

微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是保守的小非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA），長約22個核苷酸。miRNA 能夠通過與靶向miRNA 的3'非翻譯區(qū)（3′-untranslated region,3'-UTR）結合來調節(jié)基因表達，從而導致靶向miRNA翻譯抑制或降解[10,11]。改變miRNA 可以激活AMPK 信號級聯，從而保護成骨細胞免受Dex 的侵害。miRNA-429 誘導的蛋白磷酸酶2A 催化亞基（AMPK 的磷酸酶）沉默激活了AMPK并保護成骨細胞免受Dex的侵害[2]。此外，miR-1256使Ppm1e 沉默，激活AMPK，從而起到對Dex 誘導的成骨細胞保護作用[12]。

鈣結合蛋白39（calcium binding protein,CAB39）是三聚體LKB1-STRAD-CAB39蛋白復合物的關鍵成分，該復合物對于STRAD 穩(wěn)定和LKB1 激活（一個AMPK 激酶）是必不可少的[13]。LKB1-STRADCAB39結合能夠促進LKB1從細胞核轉移到細胞質，使Thr-172處的AMPKα1磷酸化[13]。沉默靶向CAB39的miRNA（miRNA-451）能夠誘導CAB39 積累并激活下游的AMPK[13-15]。miRNA-1256作為一種新型的CAB39靶向miRNA，相反，抑制miRNA-1256可誘導CAB39 上調和AMPK 信號激活，從而為Dex 誘導的成骨細胞提供顯著的細胞保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑、化學藥品和抗體

Dex（Sigma-Aldrich，密蘇里州圣路易斯），FBS、DMEM 和其他細胞培養(yǎng)試劑（Gibco，馬薩諸塞州沃爾瑟姆），抗體（Cell Signaling Tech，中國北京），所有序列、病毒構建體、引物和質粒（上海基因化學有限公司，中國上海）。

1.2 細胞培養(yǎng)

hFOB1.19成骨細胞和原代人成骨細胞被分化和培養(yǎng)[16,17]。本實驗方案已獲得南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）

提取總細胞RNA，并通過反轉錄獲得cDNA。使用描述的方案進行qPCR。

1.4 異位miR-1256過表達或抑制

將編碼miR-1256前體（premiR-1256）或miR-1256反義（antagomiR-1256）的序列亞克隆到GV-369慢病毒構建體中，然后將構建體與慢病毒包膜蛋白（psPAX2 和pMD2.G）一起轉染到HEK-293T 細胞中，濃縮培養(yǎng)上清液中的病毒lv-premiR-1256 和lv-antagomiR-1256。用慢病毒處理hFOB1.19細胞或人成骨細胞，對穩(wěn)定的細胞進行嘌呤霉素篩選10～12 d，通過qPCR測試穩(wěn)轉細胞中成熟miR-1256的表達，對照細胞用miRNA 對照慢病毒（“miR-C”）或miRNA反義對照慢病毒（“antaC”）轉染[2,7]。

1.5 RNA下拉

首先用生物素化的miR-1256模擬物或對照模擬物轉染hFOB1.19細胞24 h，然后將細胞裂解物與抗生蛋白鏈菌素包被的磁珠一起孵育（使用Pierce Magnetic RNA下拉試劑盒[18,19]）以下拉生物素捕獲的RNA復合物[18]，并通過qPCR檢測與miR-1256結合的CAB39 mRNA，最后將其水平歸一化為“輸入”對照。

1.6 CAB39 3'-UTR熒光素酶報告基因活性測定

早期描述了包含CAB39 3'-UTR 的pGL4.13（luc2/SV40）構建[7]。通過脂質轉染胺3000 與海腎熒光素酶載體和pRL-SV40 將構建體轉染到hFOB1.19細胞，然后對hFOB1.19細胞進行所應用的遺傳修飾，通過Promega試劑盒檢查CAB39 3'-UTR熒光素酶報告基因的活性[20]。

1.7 細胞功能和蛋白質測定

細胞功能研究，包括通過Cell Counting Kit-8（CCK-8）進行細胞活力檢測，通過臺盼藍染色進行細胞死亡檢測及細胞凋亡檢測，包括單鏈DNA（ssDNA）ELISA、核TUNEL 染色和caspase-3/-9 活性測定、NADPH活性測定[21,22]、Western blot法檢測、JC-1線粒體去極化測定[2,7]。

1.8 miR模擬物的轉染

將hFOB1.19細胞以50%融合度接種到六孔板中，然后用Lipofectamine 3000用500 nmol/L的miR-1256模擬物（野生型和突變體）轉染48 h。

1.9 AMPKα1短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）

向培養(yǎng)的hFOB1.19細胞中加入AMPKα1 shRNA慢病毒顆粒[2]，然后加入嘌呤霉素以選擇穩(wěn)定的細胞，Western blot法檢測到穩(wěn)定細胞中AMPKα1的敲除。

1.10 AMPKα1突變

先前的報道中所描述的顯性負性AMPKα1（dn-AMPK-α1,T172A）構建體[1,2]轉染至hFOB1.19細胞，通過嘌呤霉素（1μg/ml）篩選穩(wěn)轉細胞。

1.11 ROS測定

將細胞接種到六孔板，細胞用5μmol/L CellROX染色30 min，使用全自動熒光化學發(fā)光分析儀測試CellROX紅色熒光強度。

1.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以均數±標準差表示，采用方差分析[2,7]。

2 結果

2.1 miR-1256使人成骨細胞中的CAB39沉默并抑制AMPK級聯激活

TargetScan 數據庫顯示，miR-1256 可能在位置2265-2272（圖1A）上靶向CAB39 3'-UTR，來自數據庫的上下文分數百分比為98%，context++分數為-0.43，表明兩者之間直接結合的百分比很高（圖1A）。對miR-1256亞細胞分布的qPCR分析表明，約90%的內源性miR-1256位于hFOB1.19人成骨細胞的細胞質中（圖1B），細胞核中只有約10%（圖1B）。RNA下拉測定結果（圖1C）證實，生物素化的miR-1256可以直接與hFOB1.19細胞中的CAB39 mRNA結合（圖1C）。

為了檢測miR-1256是否可以影響CAB39表達，建立了編碼miR-1256前體序列（lv-premiR-1256）的慢病毒構建體，并將其轉導至hFOB1.19細胞，然后在含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，并建立了兩個穩(wěn)定的細胞系lv-premiR-1256-L1 和lv-premiR-1256-L2。在表達lv-premiR-1256的穩(wěn)定hFOB1.19細胞中，成熟的miR-1256水平增加了15～20倍（圖1D）。值得注意的是，miR-1256 的過表達導致hFOB1.19 細胞中CAB39 3'-UTR 熒光素酶報告基因活性急劇降低（圖1E）。此外，CAB39 mRNA 水平大幅降低（圖1F），CAB39蛋白表達在lv-premiR-1256表達的hFOB1.19細胞中也下調（圖1G）。Western blot 結果顯示，AMPKα1（Thr-172）及其下游ACC（Ser-79）的磷酸化也降低了；總AMPKα1 和ACC 的表達未改變（圖1H）。miR-1256過表達后，hFOB1.19細胞中的AMPK活性也降低（圖1I）。因此，miR-1256 過表達使hFOB1.19細胞中的CAB39沉默并抑制AMPK信號激活。

為了確認miR-1256 對CAB39 mRNA 的直接作用，生成了兩個突變miR-1256模擬物，序列在圖1J中列出。這兩個突變體（即“mu1”和“mu2”），在與CAB39 3'-UTR的結合位點處具有突變（圖1J）。將野生型（WT）和突變體分別轉染至hFOB1.19細胞，結果顯示只有WT miR-1256模擬物抑制CAB39 3'-UTR熒光素酶報告基因活性（圖1K）和mRNA 表達（圖1L）。這兩個突變體完全無效（圖1K、1L）。

在人成骨細胞中，lv-premiR-1256 感染同樣可以誘導成熟的miR-1256 過表達（圖1M）。結果顯示，CAB39 3'-UTR 熒光素酶報告基因活性（圖1N）和mRNA 表達（圖1O）顯著下調。miR-1256 過表達下調了CAB39 蛋白表達（圖1P）和AMPKα1-ACC 磷酸化（圖1Q）。這些結果表明，miR-1256直接沉默人成骨細胞中的CAB39并抑制AMPK活化。

圖1 miR-1256使人成骨細胞中的CAB39沉默并抑制AMPK級聯激活

2.2 抑制miR-1256誘導人成骨細胞中CAB39升高和AMPK級聯激活

根據圖1的結果，假設miR-1256抑制能夠誘導人成骨細胞中CAB39升高和AMPK信號激活。為了檢驗該假設建立編碼miR-1256反義序列的慢病毒構建體或lv-antagomiR-1256，并將其轉導至hFOB1.19成骨細胞。按照嘌呤霉素選擇程序，建立兩個穩(wěn)轉的細胞系lv-antagomiR-1256-L1 和lv-antagomiR-1256-L2。如圖2 所示，與“antaC”對照組的細胞相比，在表達lv-antagomiR-1256 的穩(wěn)轉hFOB1.19 細胞中成熟miR-1256表達顯著降低（圖2A）。相反，CAB39 3'-UTR熒光素酶報告基因活性（圖2B）和mRNA表達（圖2C）得到增強。此外，CAB39 蛋白在miR-1256 抑制的hFOB1.19細胞中升高（圖2D）。重要的是，miR-1256抑制后，AMPKα1-ACC磷酸化（圖2E）和AMPK活性（圖2F）顯著增加。

在人成骨細胞中，用lv-antagomiR-1256轉染可顯著抑制miR-1256（圖2G），導致CAB39 mRNA和蛋白質表達上調（圖2H、2I）以及AMPKα1-ACC 磷酸化和AMPK活性增加（圖2J、2K）。結果表明，miR-1256抑制可誘導人成骨細胞中CAB39升高和AMPK級聯激活。

圖2 miR-1256抑制誘導人成骨細胞中CAB39升高和AMPK級聯激活

2.3 miR-1256 抑制可保護人成骨細胞免受Dex 誘導的細胞毒性和細胞凋亡的影響

由于miR-1256抑制可誘導CAB39升高和AMPK級聯激活，檢測其潛在的對成骨細胞的保護作用。-在“antaC”對照組的hFOB1.19細胞中，通過CCK-8分析及臺盼藍染色法發(fā)現Dex（1 μmol/L，48 h）處理誘導了細胞活性的顯著降低（圖3A）和細胞死亡（圖3B），而在lv-antagomiR-1256表達的hFOB1.19細胞中細胞毒性有明顯減輕（圖3A、3B）。結果表明，miR-1256抑制減弱了hFOB1.19細胞中Dex誘導的細胞毒性。

此外，在“antaC”對照組的OB-6細胞中，加入Dex干預可以發(fā)生明顯的細胞凋亡：caspase-3/caspase-9活性升高（圖3C、3D），TUNEL 陽性細胞核比例升高（圖3E）。值得注意的是，在lv-antagomiR-1256 轉染的hFOB1.19 細胞中Dex 誘導的細胞凋亡有所減少（圖3C～3E）。在原代人成骨細胞中可以獲得相似的結果，其中l(wèi)v-antagomiR-1256 組改善了Dex 對于細胞活性的抑制（圖3F）并降低了細胞死亡（圖3G）。此外，在lv-antagomiR-1256 組中，caspase-3/-9 活性（圖3H、3I）和TUNEL 陽性核比（圖3J）均比“antaC”組降低，表示Dex誘導的細胞凋亡也受到抑制。miR-1256抑制作用保護了人成骨細胞免受Dex 誘導的細胞毒性和細胞凋亡的影響

圖3 miR-1256抑制作用可保護人類成骨細胞免受Dex誘導的細胞毒性和細胞凋亡的影響

2.4 miR-1256 抑制可減輕Dex 誘導的人成骨細胞氧化損傷

通過激活AMPK清除ROS可以保護成骨細胞免受Dex誘導的氧化損傷的影響。本研究結果顯示，在表達lv-antagomiR-1256 的hFOB1.19 成骨細胞中，NADPH 活性顯著提高（圖4A）。此外，在miR-1256抑制后誘導了Nrf2 級聯基因的mRNA 表達，包括HO1，NQO1和GCLC[4,7,23]（圖4B）。

通過使用CellROX染料分析，發(fā)現Dex處理增加了“antaC”組hFOB1.19細胞的細胞ROS含量（CellROX熒光）（圖4C、4D）。此外，通過增強的TBAR 活性測試，在Dex 處理的對照hFOB1.19 細胞中檢測到明顯的脂質過氧化作用（圖4E）。為了進一步確認氧化損傷，在hFOB1.19細胞中進行了Dex處理后，檢測到了明顯的線粒體去極化作用（圖4F、4G）。線粒體去極化已通過JC-1 綠色單體積累進行了檢測（圖4F、4G）。另外，Dex處理在對照hFOB1.19成骨細胞中誘導了顯著的DNA 斷裂（ssDNA 積累）（圖4H）。重要的是，lv-antagomiR-1256 對miR-1256 的抑制作用減弱了hFOB1.19 成骨細胞中Dex 誘導的氧化損傷（圖4C～4H）。在表達lv-antagomiR-1256 的hFOB1.19 細胞中，Dex 誘導的ROS 產生（圖4C、4D），脂質過氧化（圖4E），線粒體去極化（圖4F、4G）和ssDNA 的積累（圖4H）被極大抑制。

在原代人成骨細胞中，lv-antagomiR-1256誘導的miR-1256抑制作用類似地減弱了Dex誘導的ROS產生（圖4I、4J）和線粒體去極化（圖4K、4L）。這些結果表明，miR-1256 抑制可減輕Dex 誘導的人成骨細胞氧化損傷。

圖4 miR-1256抑制作用減輕了Dex誘導的人類成骨細胞的氧化損傷

3 討論

Fan 等[12]的研究表明，miRNA-135b 誘導蛋白磷酸酶1E（protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1E,PPM1E）沉默，可激活AMPK 信號傳導并發(fā)揮對Dex 的成骨細胞保護作用。較長的非編碼RNA MALAT1 使PPM1E 沉默并激活AMPK 級聯，從而為成骨細胞提供細胞保護作用[23]。先前的研究已經表明，miR-429 使PP2A（PP2A-c）的催化亞基沉默并激活了AMPK信號傳導，miR-429過表達的成骨細胞免受Dex 誘導的氧化損傷和細胞死亡的影響[2]。抑制miR-107激活AMPK依賴性Nrf2信號級聯反應，從而抑制Dex誘導的hFOB1.19細胞和人成骨細胞的氧化損傷和細胞凋亡[7]。

研究發(fā)現miR-1256是人成骨細胞中靶向CAB39的新型miRNA。miR-1256 主要位于hFOB1.19 成骨細胞的胞漿中，并與CAB39 mRNA 直接相關。在hFOB1.19 成骨細胞和人成骨細胞中，異位miR-1256過表達后，CAB39 3'-UTR熒光素酶報告基因的活性以及CAB39 mRNA 和蛋白質的表達顯著降低，但抑制miR-1256 能夠使上述分子的活性或表達作用增強。重要的是，兩個突變體miR-1256 模擬物在與CAB39 3'-UTR 的結合位點處含有突變，未能抑制hFOB1.19細胞中CAB39 3'-UTR 熒光素酶報告基因的活性和mRNA表達。因此，miR-1256直接與人成骨細胞中的CAB39結合并使其沉默。在hFOB1.19細胞和人成骨細胞中，lv-antagomiR-1256對miR-1256的抑制作用很大程度上抑制了Dex誘導的細胞死亡和細胞凋亡。

先前研究表明，化合物991（苯并咪唑衍生物的小分子AMPK激活劑）可以抑制Dex誘導的MC3T3-E1成骨細胞和原代鼠成骨細胞的氧化損傷[4]?；衔?91 對AMPK 的激活增強了NADPH 的活性，并激活了Nrf2信號傳導，從而抑制Dex誘導的成骨細胞氧化損傷[4]。同樣，由α1 選擇性激活劑化合物13 進行的AMPK 激活在很大程度上抑制了Dex 誘導的成骨細胞凋亡[1]。C13 誘導的成骨細胞的細胞保護作用與AMPK依賴的NADPH產生和ROS清除有關[1]。

lv-antagomiR-1256 誘導的miR-1256 抑制作用增加了NADPH 活性并誘導了Nrf2 級聯基因的表達，從而抑制了Dex 誘導的hFOB1.19 細胞和人成骨細胞的氧化損傷。另外，在lv-antagomiR-1256 轉染的hFOB1.19 細胞和人成骨細胞中，均可看到在miR-1256 被抑制后，CAB39 基因及蛋白表達上調及AMPKα1-ACC 磷酸化和AMPK 活性增加。因此，抑制miR-1256 可能是通過激活CAB39-AMPK 信號通路，發(fā)生ROS 清除和氧化應激抑制，從而起到對Dex誘導的成骨損傷的保護作用。對于Dex 誘導的成骨細胞保護的機制還有待進一步的研究。

4 結論

miR-1256抑制可以保護成骨細胞免受Dex誘導的氧化損傷，其機制可能與激活CAB39-AMPK 信號通路有關。本研究為治療Dex 所致的成骨損傷相關疾病提供了治療的新方向，為今后的臨床應用奠定了基礎。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突