單輝，汪璐*，劉健，羅建平，楊磊

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236400）

色素可分為人工合成色素和天然色素。人工合成色素因其價(jià)格低廉、著色穩(wěn)定而被廣泛應(yīng)用[1-2]。然而，近年來(lái)人們從合成色素毒理學(xué)方面的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，合成色素多以苯、甲苯、萘等有機(jī)試劑為原料，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成，對(duì)人體具有毒性。隨著研究的深入，許多國(guó)家已開始禁止人工合成色素的使用[3]，并尋求天然色素作為代替品。相較于人工合成色素，天然紅色素主要來(lái)源于微生物[4]、動(dòng)物和植物[5-7]，該類色素不僅具有著色的作用，而且具有抗氧化、抗癌和預(yù)防神經(jīng)元、心血管以及脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的作用[8-14]。隨著人們生活水平的提高，天然、非人工合成的產(chǎn)品，將越來(lái)越受消費(fèi)者青睞，因此天然紅色素作為一種安全無(wú)毒，且具有多種生物活性的天然著色劑，未來(lái)市場(chǎng)前景廣闊，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

芥菜疙瘩（Brassica napiformis），別名辣疙瘩、大頭菜等，為十字花科蕓薹屬常見(jiàn)蔬菜。該蔬菜易栽培、產(chǎn)量高，在我國(guó)大部分地區(qū)都有種植，主要被加工成腌制小菜等附加值較低的產(chǎn)品。除此之外，因其單一的產(chǎn)品和低端的加工方式，每年都有大量芥菜疙瘩因得不到及時(shí)加工而被遺棄，不僅污染環(huán)境而且造成資源的極大浪費(fèi)。因此，急需對(duì)芥菜疙瘩進(jìn)行高值化的開發(fā)和利用。目前關(guān)于芥菜疙瘩的研究，主要集中在該植物的育種、栽培以及腌制加工等方面[15-16]，未見(jiàn)有通過(guò)芥菜疙瘩制備紅色素的相關(guān)報(bào)道。為了實(shí)現(xiàn)芥菜疙瘩的高值化加工，本論文以芥菜疙瘩為原料經(jīng)過(guò)一定加工處理，提取、精制，得到芥菜疙瘩紅色素，并對(duì)芥菜疙瘩紅色素的穩(wěn)定性和抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為芥菜疙瘩產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一個(gè)新的方向，同時(shí)也為芥菜疙瘩紅色素的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥菜疙瘩塊根：安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，洗凈，晾干，稱重，保鮮膜包裹后，避光保存在-25℃冰箱中；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；AB-8大孔吸附樹脂：上海源葉生物有限公司；乙醇（分析純）：北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、噻唑藍(lán) [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：北京索萊寶科技有限公司；達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）糖培養(yǎng)基：上海賽默飛生物技術(shù)有限公司；胎牛血清：美國(guó)bioscience公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Hei-VAP ML）：德國(guó)Heidolph公司；紫外照射燈管（PL-S 9W/01/2P UVB）：波蘭PHILIPS公司；恒溫CO2培養(yǎng)箱（MCO-17AJC）：日本SANYO公司；紫外分光光度計(jì)（TU-1901）：北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；榨汁機(jī)（JYZ-D51）：九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芥菜疙瘩紅色素的制備

1.3.1.1 芥菜疙瘩紅色素的提取

芥菜疙瘩塊根用榨汁機(jī)充分榨汁（15 000 r/min）得芥菜疙瘩原汁和渣（渣和汁分離）；取和芥菜疙瘩原汁相同體積的水對(duì)渣進(jìn)行水洗得芥菜疙瘩水洗汁；將原汁和水洗汁混合，離心（室溫25℃，10 000 r/min，5 min），收集上清液備用。

取上清液分別置于 20、40、60、80、100 ℃條件下加熱3 h后，離心，收集上清，得芥菜疙瘩紅色素提取液。取芥菜疙瘩紅色素提取液3 mL于比色皿中，以蒸餾水作為參比，在400 nm～800 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行光譜掃描，記錄該色素在最大吸收波長(zhǎng)556 nm處的吸光值，探究加熱溫度對(duì)色素提取的影響。

取上清液置于80℃條件下分別加熱0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 后離心，收集上清，在 556 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度，探究加熱時(shí)間對(duì)色素提取的影響。

按上述最佳提取條件獲得的芥菜疙瘩紅色素提取液，通過(guò)濃縮、冷凍干燥得芥菜疙瘩紅色素提取物固體。取芥菜疙瘩紅色素提取物400 mg溶于20 mL蒸餾水中，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的芥菜疙瘩紅色素提取液備用。

取上述紅色素提取液，分別加入不同體積的無(wú)水乙醇，配成乙醇濃度為 0%、20%、40%、60%、80%（體積分?jǐn)?shù)）紅色素質(zhì)量濃度為4 mg/mL的乙醇紅色素溶液。將配好的溶液置于4℃環(huán)境中12 h后，離心，取上清，得不同濃度乙醇的芥菜疙瘩紅色素溶液備用。

取3 mL不同濃度乙醇的紅色素溶液于比色皿中，以蒸餾水作為參比，在556 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度；采用苯酚-硫酸法[17]和考馬斯亮藍(lán)法[18]檢測(cè)不同濃度乙醇的紅色素溶液中糖和蛋白質(zhì)吸光度的變化。乙醇提取后的芥菜疙瘩紅色素溶液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得芥菜疙瘩紅色素粗提物。

1.3.1.2 AB-8大孔吸附樹脂對(duì)芥菜疙瘩紅色素的吸附純化

取30 mg/mL的芥菜疙瘩紅色素粗提液200 mL與50 g預(yù)先處理[19]的AB-8大孔吸附樹脂充分吸附后，加入層析柱中（柱體積2.6 cm×60 cm）。以10 mL/min的流速用蒸餾水進(jìn)行洗脫，當(dāng)洗脫液中不再含有糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后，換入濃度為5%的乙醇，以10 mL/min流速，洗脫層析柱。乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得芥菜疙瘩紅色素，根據(jù)公式（1）計(jì)算芥菜疙瘩紅色素得率（W）。

式中：m為芥菜疙瘩紅色素質(zhì)量，mg；m0為芥菜疙瘩紅色素粗提物質(zhì)量，mg。

1.3.2 芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性研究

1.3.2.1 色素保存率的計(jì)算

以色素保存率來(lái)表示芥菜疙瘩紅色素的穩(wěn)定性，根據(jù)式（2）計(jì)算色素保存率[20]。

式中：A0為初始色素溶液或空白對(duì)照色素溶液在最大吸收峰處吸光度；At為色素溶液在最大吸收峰處t時(shí)間的吸光度。

1.3.2.2 pH值對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

取2mg/mL的芥菜疙瘩紅色素溶液9mL，測(cè)得此時(shí)溶液pH值為4.31。用1mol/L的鹽酸和1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅色素溶液 pH 值分別至 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，加蒸餾水定容至 10 mL[21]，用蒸餾水代替酸堿溶液加入色素溶液中，作為空白對(duì)照。渦旋振蕩，充分混勻后，測(cè)定不同pH值下紅色素溶液的最大吸收波長(zhǎng)。將溶液置于25℃、光照強(qiáng)度為300lx環(huán)境中，定時(shí)取樣測(cè)定吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算色素保存率。

1.3.2.3 光照對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

取2 mg/mL的芥菜疙瘩紅色素溶液和一定量的芥菜疙瘩紅色素固體于透明玻璃試管中，分別置于4℃避光、25℃避光、50℃避光、4℃光照、25℃光照、50℃光照（光照強(qiáng)度為300 lx環(huán)境中，及時(shí)記錄溶液初始吸光度，定時(shí)取樣測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)該色素的吸光度，其中固體紅色素溶于蒸餾水中配成2 mg/mL的紅色素溶液用于檢測(cè)吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算色素保存率。

1.3.2.4 食品添加劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

取2 mg/mL的芥菜疙瘩紅色素溶液于試管中，加入食品添加劑（葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、維生素C、氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀、檸檬酸、焦亞硫酸鈉），使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%。將溶液渦旋振蕩混勻，及時(shí)記錄溶液初始吸光度后，置于25℃、光照強(qiáng)度為300 lx的環(huán)境中，定時(shí)取樣測(cè)定吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算色素保存率。

1.3.3 芥菜疙瘩紅色素的抗氧化活性

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

取1 mL芥菜疙瘩紅色素溶液（濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL），加入 1 mL 0.017 8 mmol/L的DPPH-乙醇溶液迅速渦旋混勻后，置于室溫環(huán)境下避光反應(yīng)30 min后取出，作為試驗(yàn)組；以蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液作為空白組；以蒸餾水代替芥菜疙瘩紅色素溶液作為對(duì)照組，分別測(cè)定517 nm波長(zhǎng)下的吸光度，記為 A、A0、A1[22]，根據(jù)式（3）計(jì)算自由基清除率。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]的方法配制ABTS儲(chǔ)備溶液，備用。取濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL 的芥菜疙瘩紅色素溶液200 μL，加入6 mL ABTS儲(chǔ)備液迅速渦旋混勻后，室溫25℃環(huán)境下避光反應(yīng)30 min后取出，作為試驗(yàn)組；以蒸餾水代替ABTS儲(chǔ)備液作為空白組；以蒸餾水代替芥菜疙瘩紅色素溶液作為對(duì)照組，分別測(cè)定734 nm波長(zhǎng)下的吸光度，記為A、A0、A1，根據(jù)式（3）計(jì)算自由基清除率。

1.3.3.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

取 2 mL 濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的芥菜疙瘩紅色素溶液，加入1.4 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，2 mL 1.5 mmol/L FeSO4溶液，0.6 mL 20 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液渦旋混勻，置于37℃恒溫水浴1 h，作為試驗(yàn)組；以蒸餾水代替H2O2、FeSO4、水楊酸-乙醇溶液作為空白組；以蒸餾水代替芥菜疙瘩紅色素溶液作為對(duì)照組，分別測(cè)定510 nm波長(zhǎng)下的吸光度，記為A、A0、A1[24]，根據(jù)式（3）計(jì)算自由基清除率。

1.3.4 芥菜疙瘩紅色素對(duì)UVB光損傷HaCaT細(xì)胞的修復(fù)作用

1.3.4.1 細(xì)胞分組

HaCaT細(xì)胞懸液濃度為1.0×104個(gè)/mL，其中空白對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)基；正常組：細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h；模型組：細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，給予40 mJ/cm2劑量UVB輻照，再培養(yǎng)24 h；試驗(yàn)組-1：細(xì)胞在含有不同芥菜疙瘩紅色素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h；試驗(yàn)組-2：細(xì)胞在含有芥菜疙瘩紅色素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，給予40 mJ/cm2劑量UVB輻照，再在含有芥菜疙瘩紅色素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。

1.3.4.2 芥菜疙瘩紅色素對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)[25]。待細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行消化，以1.0×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板，用不同質(zhì)量濃度的芥菜疙瘩紅色素處理細(xì)胞48 h后，采用MTT法并根據(jù)式（4）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

式中：A、A0、A1分別為試驗(yàn)組-1、空白組、正常組在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4.3 UVB照射損傷模型的建立

將 HaCaT 細(xì)胞，以 1.0×104個(gè)/mL、每孔 100 μL 接種于96孔板。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將試驗(yàn)組原培養(yǎng)基換成10 μL PBS[26]，用不同劑量的UVB照射細(xì)胞。照射完成后在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法并根據(jù)式（4）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3.4.4 指標(biāo)測(cè)定

收集各組細(xì)胞，重懸至1.0×106個(gè)/mL，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD活性、MDA和GSH含量；根據(jù)MTT法和式（4）計(jì)算損傷細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，應(yīng)用One-way ANOVA方法分析各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)間的顯著性差異關(guān)系；Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜疙瘩紅色素的制備

2.1.1 芥菜疙瘩紅色素的提取

芥菜疙瘩汁液通過(guò)加熱、乙醇提取獲得芥菜疙瘩紅色素粗提液，不同因素對(duì)芥菜疙瘩紅色素制備的影響見(jiàn)圖1。

圖1 芥菜疙瘩紅色素的制備Fig.1 Preparation of Brassica napiformis red pigment

如圖1A所示，當(dāng)加熱溫度為80℃時(shí)，溶液吸光度最高，因此選擇80℃作為制備芥菜疙瘩紅色素的最佳溫度。在最佳制備溫度條件下，探究不同加熱時(shí)間對(duì)芥菜疙瘩紅色素制備的影響，如圖1B所示，當(dāng)加熱時(shí)間為3 h時(shí)，溶液吸光度最高，因此選擇3 h作為制備紅色素的最佳加熱時(shí)間。高濃度的乙醇通過(guò)使一些糖和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生沉淀，達(dá)到對(duì)溶液中紅色素的提取。通過(guò)評(píng)價(jià)乙醇濃度對(duì)紅色素提取液中紅色素、糖和蛋白質(zhì)吸光度的影響，最終確定乙醇提取的最佳濃度。隨著乙醇濃度的升高，糖和蛋白質(zhì)的含量明顯降低，但紅色素的吸光度沒(méi)有明顯變化，因此選擇80%的乙醇作為紅色素提取的最佳乙醇濃度。

2.1.2 芥菜疙瘩紅色素的純化

芥菜疙瘩紅色素粗提物中依然含有部分糖和蛋白質(zhì)等極性較大的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)同紅色素一起被AB-8大孔吸附樹脂所吸附。首先用蒸餾水對(duì)其中的糖和蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，直至完全除去，再用5%乙醇溶液對(duì)芥菜疙瘩紅色素進(jìn)行解吸附，從而達(dá)到純化的效果。以蒸餾水洗脫液體積為橫坐標(biāo)，糖和蛋白質(zhì)分別在苯酚-硫酸和考馬斯亮藍(lán)溶液體系中的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制糖和蛋白質(zhì)的洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 AB-8大孔吸附樹脂對(duì)芥菜疙瘩紅色素的純化Fig.2 Purification of Brassica napiformis red pigment by AB-8 macroporous adsorption resin

如圖2A、2B所示，最終需要約500 mL的蒸餾水可以將樹脂中的糖和蛋白質(zhì)洗脫除去；以5%乙醇洗脫液體積為橫坐標(biāo)，色素吸光度為縱坐標(biāo)繪制紅色素的洗脫曲線，如圖2C所示，隨著解吸溶液體積的增加，色素被逐漸洗脫，收集色素洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得芥菜疙瘩紅色素，根據(jù)公式（1）計(jì)算其得率為（3.26±0.014）%。

2.2 芥菜疙瘩紅色素的穩(wěn)定性

2.2.1 pH值對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

通過(guò)調(diào)節(jié)芥菜疙瘩紅色素溶液pH值，探究pH值對(duì)芥菜疙瘩紅色素最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度和保存率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of the red pigment from Brassica napiformis

由圖3可知，隨著pH值的升高，芥菜疙瘩紅色素在最大吸收波長(zhǎng)556 nm處的吸光度逐漸降低，說(shuō)明pH值會(huì)影響紅色素在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度；芥菜疙瘩紅色素在pH＜5的酸性條件下較為穩(wěn)定，當(dāng)pH＞5時(shí)紅色素吸光度會(huì)隨著pH值的增加而降低；在相同pH值條件下，芥菜疙瘩紅色素的吸光度在8 h內(nèi)不隨時(shí)間的變化而變化。

2.2.2 光照對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

將芥菜疙瘩紅色素溶液和芥菜疙瘩紅色素固體，分別放置在不同光照條件下，探究光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 光照對(duì)芥菜疙瘩紅色素溶液穩(wěn)定性的影響Table 1 Effect of illumination on the stability of the red pigment solution from Brassica napiformis

表2 光照對(duì)芥菜疙瘩紅色素固體穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of illumination on the stability of the red pigment solid from Brassica napiformis

如表1所示，芥菜疙瘩紅色素溶液在50℃、300 lx光照條件下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色素保存率逐漸下降；低溫4℃避光條件下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色素保存率也變小，但色素的流失沒(méi)有高溫光照嚴(yán)重。由表2可以看出，芥菜疙瘩紅色素固體較為穩(wěn)定，無(wú)論是在高溫光照環(huán)境下，還是在低溫避光環(huán)境中，在7 d內(nèi)其色素保存率不發(fā)生明顯變化，因此，芥菜疙瘩紅色素可以固體形式長(zhǎng)期貯存。

2.2.3 食品添加劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響

天然紅色素廣泛應(yīng)用于食品加工，因此探究食品添加劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素的穩(wěn)定性具有現(xiàn)實(shí)意義。食品添加劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表3。

表3 食品添加劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of food additives on the stability of the red pigment from Brassica napiformis

由表3可知，芥菜疙瘩紅色素在糖類添加劑和抗氧化劑中保持穩(wěn)定；在一些含有金屬離子的食品添加劑中色素保存率顯著升高，分析原因是由于一些金屬離子會(huì)和紅色素產(chǎn)生共軛反應(yīng)，從而提高紅色素的保存率[23]；焦亞磷酸鈉作為一種防腐劑可以顯著降低紅色素的保存率，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其保存率持續(xù)降低。因此，芥菜疙瘩紅色素在使用過(guò)程中應(yīng)盡量避免同焦亞磷酸鈉接觸。

2.3 芥菜疙瘩紅色素抗氧化活性研究

以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，探究芥菜疙瘩紅色素對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 芥菜疙瘩紅色素對(duì)自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activity of the red pigment from Brassica napiformis against free radicals

如圖4所示，芥菜疙瘩紅色素對(duì)DPPH、ABTS+、羥自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)隨著樣品濃度的升高其清除能力也逐漸提高。當(dāng)芥菜疙瘩紅色素的質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH、ABTS+、羥自由基清除能力最強(qiáng)，分別為（94.62±0.47）%、（71.74±1.66）%和（74.81±2.93）%。

2.4 芥菜疙瘩紅色素對(duì)UVB光損傷HaCaT細(xì)胞的修復(fù)作用

2.4.1 芥菜疙瘩紅色素對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

將HaCaT細(xì)胞置于含有不同濃度芥菜疙瘩紅色素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，探究該色素對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 芥菜疙瘩紅色素對(duì)HaCaT細(xì)胞相對(duì)存活率的影響Fig.5 Effect of Brassica napiformis red pigment on relative survival rate of HaCaT cells

如圖5所示，HaCaT細(xì)胞在含有不同濃度芥菜疙瘩紅色素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，相對(duì)于正常組，細(xì)胞的相對(duì)存活率并無(wú)顯著性變化。因此，當(dāng)培養(yǎng)液中色素濃度在20 mg/L～200 mg/L時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著性影響。

2.4.2 UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

將HaCaT細(xì)胞分別給予不同劑量的UVB輻照，探究UVB輻照對(duì)細(xì)胞相對(duì)存活率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 UVB輻照對(duì)HaCaT細(xì)胞相對(duì)存活率的影響Fig.6 Effect of UVB irradiation on relative survival rate of HaCaT cells

由圖6可知，隨著輻照劑量的增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降，表明一定劑量的UVB照射會(huì)影響細(xì)胞的存活率。在輻照劑量為40 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞的存活率為（56.57±2.07）%，當(dāng)輻照劑量超過(guò) 40 mJ/cm2時(shí)，細(xì)胞的存活率下降至50%以下。因此選擇40 mJ/cm2作為HaCaT細(xì)胞的最佳UVB輻照強(qiáng)度，能夠?qū)?xì)胞造成一定程度的傷害，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有太大的影響。

2.4.3 芥菜疙瘩紅色素對(duì)UVB光損傷的HaCaT細(xì)胞中SOD活性、MDA、GSH含量以及細(xì)胞增殖的影響

如1.3.4.4方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性，MDA、GSH含量以及細(xì)胞相對(duì)存活率，探究芥菜疙瘩紅色素對(duì)UVB損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 芥菜疙瘩紅色素對(duì)UVB損傷細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.7 Protective effect of Brassica napiformis red pigment on UVB-damaged cells

由圖7可知，相較于正常組，模型組HaCaT細(xì)胞中的SOD活性和GSH含量以及細(xì)胞相對(duì)存活率顯著降低，MDA含量顯著升高；經(jīng)芥菜疙瘩紅色素培養(yǎng)48 h后，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞中的SOD活性和GSH含量及其細(xì)胞相對(duì)存活率顯著升高，MDA水平顯著降低，且均呈劑量依賴性變化；由此可知，芥菜疙瘩紅色素可以通過(guò)提高損傷細(xì)胞中SOD活性和GSH含量，以及降低MDA含量的方式來(lái)發(fā)揮抗氧化和保護(hù)細(xì)胞的作用。

3 結(jié)論

以芥菜疙瘩根塊為原料提取紅色素，并對(duì)其制備工藝及其穩(wěn)定性與抗氧化活性進(jìn)行研究。通過(guò)單因素分析法得芥菜疙瘩紅色素粗提物制備的最適溫度為80℃、最佳加熱時(shí)間為3 h、乙醇提取的最適濃度為80%（體積分?jǐn)?shù)）；芥菜疙瘩紅色素粗提物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后得芥菜疙瘩紅色素。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，芥菜疙瘩紅色素在酸性條件下較為穩(wěn)定，在堿性條件下其保存率顯著降低；相較于低溫避光環(huán)境中，芥菜疙瘩紅色素溶液在高溫光照條件下穩(wěn)定性較差，固體紅色素?zé)o論是在高溫光照還是低溫避光條件下都呈現(xiàn)非常穩(wěn)定的狀態(tài)，因此在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)盡量以固體形式保存；糖類化合物和抗氧化劑對(duì)芥菜疙瘩紅色素穩(wěn)定性的影響較小，一些金屬離子和檸檬酸可以提高色素保存率，而焦亞磷酸鈉對(duì)色素穩(wěn)定性的影響較為明顯，因此，芥菜疙瘩紅色素應(yīng)盡量避免同焦亞磷酸鈉一起使用?？寡趸钚越Y(jié)果表明，芥菜疙瘩紅色素對(duì)DPPH、ABTS+和羥自由基均有一定的清除能力；與此同時(shí)，芥菜疙瘩紅色素可以顯著提高損傷細(xì)胞中SOD活性、GSH含量和細(xì)胞相對(duì)存活率，同時(shí)顯著降低MDA含量來(lái)發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用。