凌 秋 謝新暉 楊和增 賴文濤 趙 杰 劉泱慧 榮 晗,,*

1.安徽醫(yī)科大學(xué)深圳精神衛(wèi)生臨床學(xué)院 (廣東 深圳 518020)

2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院 (湖北 武漢 430060)

3.深圳市精神衛(wèi)生中心/深圳市康寧醫(yī)院 (廣東 深圳 518020)

精神分裂癥(schizophrenia，SCZ)是一種病因未明、慢性和嚴(yán)重的精神障礙，臨床上主要以妄想、幻覺、言語(yǔ)紊亂、明顯紊亂的或緊張癥的行為、陰性癥狀為表現(xiàn)，影響親密關(guān)系、個(gè)人才能、家庭關(guān)系及經(jīng)濟(jì)獨(dú)立性的正常發(fā)展。一些研究[1]表明，一些神經(jīng)精神疾病如情緒障礙、自閉癥譜系障礙、帕金森病和SCZ與居住在胃腸道的微生物組成的改變有不可分割的關(guān)系。腸道微生物群的失調(diào)有可能在精神障礙的發(fā)病機(jī)制起作用，側(cè)面證實(shí)了腸道和大腦之間雙向交流的假設(shè)。因此微生物-腸-腦(Microbiota-Gut-Brain，MGB)軸的概念應(yīng)運(yùn)而生。腸道微生物通過神經(jīng)系統(tǒng)(如迷走神經(jīng)、腸神經(jīng)系統(tǒng))、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(下丘腦-垂體-腎上腺軸)和微生物代謝物(如短鏈脂肪酸)與大腦進(jìn)行交流[2]，互相交流，彼此調(diào)控。但是，目前有關(guān)人類精神分裂癥與腸道微生物相關(guān)研究的數(shù)據(jù)存在不一致[3]，且腸道微生物是個(gè)復(fù)雜且龐大的生態(tài)系統(tǒng)，不同地區(qū)、不同性別、不同年齡階段人群其腸道微生物都存在一定差異。本研究對(duì)精神分裂癥患者腸道菌群進(jìn)行16SRNA基因高通量測(cè)序，探索其腸道菌群特征及可能的病理機(jī)制，為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年10月至2020年12月在深圳市康寧醫(yī)院住院的20名精神分裂癥患者作為精神分裂癥(SCZ)組，

納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲～60歲，男女不限；采用簡(jiǎn)明國(guó)際精神神經(jīng)障礙訪談(Mini International Neuropsychiatric Interview，M.I.N.I)，滿足國(guó)際疾病分類第1 0 版(I n t e r n a t i o n a l Classification of Disease，Tenth Edition，ICD-10)關(guān)于精神分裂癥的診斷條目；病程≥2年；小學(xué)以上文化。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他精神疾病診斷；有精神活性物質(zhì)依賴或?yàn)E用；合并糖尿病、高血壓、內(nèi)分泌疾病、心腦血管疾病等軀體疾病和腦器質(zhì)性疾病；曾行腹部手術(shù)，或近3月發(fā)生過腸道感染；極端飲食，如素食主義；入組前4周內(nèi)使用過抗生素、益生菌、益生元、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素；妊娠及哺乳期婦女。

選取同時(shí)期周邊社區(qū)的健康志愿者60名作為健康對(duì)照(healthy control，HC)組(按1∶3比例)，納入標(biāo)準(zhǔn)為：18歲～60歲，男女不限；經(jīng)精神科醫(yī)師評(píng)估不患有任何精神障礙；小學(xué)以上文化。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他精神疾病診斷；有精神活性物質(zhì)依賴或?yàn)E用；合并糖尿病、高血壓、內(nèi)分泌疾病、心腦血管疾病等軀體疾病和腦器質(zhì)性疾??；曾行腹部手術(shù)，或近3月發(fā)生過腸道感染；極端飲食，如素食主義；入組前4周內(nèi)使用過抗生素、益生菌、益生元、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素；妊娠及哺乳期婦女。

本研究已通過深圳市康寧醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。所有研究對(duì)象均自愿簽署知情同意書，測(cè)試前告知被試者及監(jiān)護(hù)人實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皽y(cè)試內(nèi)容。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 在入組當(dāng)天，由接受過一致性培訓(xùn)的精神科醫(yī)師對(duì)所有入組對(duì)象進(jìn)行病史采集、精神檢查和體格檢查，收集一般臨床資料(如性別、年齡、身高、體重)，并對(duì)精神分裂癥組患者進(jìn)行簡(jiǎn)明精神病評(píng)定量表(Brief Psychiatric Rating Scale，BPRS)評(píng)定。

1.2.2 糞便標(biāo)本采集 工作人員采集所有受試者新鮮糞便樣本于50mL無(wú)菌采便盒內(nèi)，立即進(jìn)行分裝并標(biāo)記，將樣本保存于-80℃冰箱內(nèi)低溫保存，至所有樣本采集完畢后統(tǒng)一送檢，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

1.2.3 糞便標(biāo)本DNA提取 取100mg組織標(biāo)本，采用MagPure Stool DNA KF kit B(Magen，中國(guó)) 按照說明書操作提取樣本總DNA，使用Qubit dsDNA BR分析試劑盒 (Invitrogen，美國(guó))測(cè)定DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。

1.2.4 樣本文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序 將經(jīng)檢驗(yàn)完成質(zhì)量合格的30ng DNA樣品及V3-V4可變區(qū)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，構(gòu)建文庫(kù)。后將檢測(cè)合格的文庫(kù)采用MiSep(Illumina，美國(guó)) 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾得到有效數(shù)據(jù)，在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對(duì)相似性序列進(jìn)行聚類分析，得到操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)，然后通過OUT與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OUT進(jìn)行物種注釋，基于OUT和物種注釋結(jié)果進(jìn)行組間物種復(fù)雜分析及組間物種差異分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用R 4.0.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組一般人口學(xué)資料中計(jì)數(shù)和分類資料比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用Welch兩樣本t檢驗(yàn)/秩和檢驗(yàn)，顯著性水平Alpha為＜0.05(雙側(cè))。通過16S RNA測(cè)序得到的數(shù)據(jù)，菌群豐度和種類進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，組間多樣性假設(shè)檢驗(yàn)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)、置換多元方差分析。腸道微生物數(shù)據(jù)應(yīng)用Qiime2[4](Quantitative Insights into Microbial Ecology)和microbiomeanalyst[5]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)資料分析本研究入組的SCZ組和HC組在年齡(P=0.818)、性別(P=0.488)、身高(P=0.824)、體重(P=0.661)、BMI(P=0.548)的兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有1例SCZ患者留取大便標(biāo)本不合格且未再留標(biāo)本，剩余的19例SCZ患者在一周內(nèi)均有服用非典型抗精神病藥等藥物。另外，1名健康對(duì)照后續(xù)磁共振檢查發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性改變，3名健康對(duì)照因第一次留大便不合格且后續(xù)未再留標(biāo)本，4名健康對(duì)照因個(gè)人原因要求退出本研究，故精神分裂癥組最終納入19例，健康對(duì)照組最終共納入52例。本研究的人口統(tǒng)計(jì)信息和統(tǒng)計(jì)分析詳見表1。

表1 組間人口學(xué)資料比較

2.2 微生物組整體概覽通過物種累積曲線評(píng)估，表明本研究的測(cè)序的深度是足夠的，并且能各自代表該組的微生物菌群的生物學(xué)信息，見圖1。

圖1 SCZ組和HC組物種累積曲線

2.3 腸道微生物多樣性分析

2.3.1 Alpha-多樣性 在本研究中，計(jì)算腸道微生物的Alpha-多樣性采用的是Chao1、ACE、Shannon、Simpson這4種參數(shù)。其中，SCZ組和HC組的組間差異性在Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.159、0.256、0.256和0.272)，結(jié)果見圖2。

圖2 SCZ組和HC組Alpha-多樣性指數(shù)

2.3.2 Beta-多樣性 圖3展示的是Beta-多樣性的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)圖，進(jìn)行置換多元方差分析(PERMANOVA)檢驗(yàn)結(jié)果：F=3.641，R2=0.050；P＜0.002。組間Beta-多樣性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是從圖3顯示的Beta-多樣性PCoA圖和置信橢圓的分布來(lái)看，總體的物種組成上大部分相似，但仍有一些樣本不同。其中PCoA的結(jié)果的軸1和2分別解釋了25.1%和11.8%的方差。

圖3 SCZ組和HC組Beta-多樣性的主坐標(biāo)分析(PCoA)圖

2.4 腸道微生物結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 腸道微生物結(jié)構(gòu)組間差異分析 根據(jù)線性判別效應(yīng)(Linear Discriminant Analysis Effect Size，LEfSe)方法做菌群差異分析，以發(fā)現(xiàn)兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群標(biāo)志物，其中用線性判別分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)估計(jì)每個(gè)差異菌群的效應(yīng)大小，LDA閾值效應(yīng)值(Score)設(shè)置為2，P取值為0.05(FDR校正)。

本研究分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同分類水平上共找到8個(gè)具有差異的菌，具體見表2。在科水平有疣微菌科和毛螺菌科；在屬水平，糞桿菌屬、Butyricicoccus、毛螺菌屬、氏菌屬及桿菌屬；在種水平，普拉梭菌、Butyricicoccus pullicaecorum和Roseburia faecis，以上這些菌群在SCZ組的相對(duì)豐度較HC組低，并且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P(FDR)＜0.05]。SCZ組和HC組組間具有差異性的菌群在各物種水平下LDA結(jié)果如圖4所示。

表2 SCZ組和HC組差異菌的Lefse分析特征表

圖4 SCZ組和HC組在各物種水平下LDA結(jié)果

2.4.2 組間差異性菌群與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 對(duì)SCZ組和HC組兩組間具有差異性的腸道微生物與患者的臨床參數(shù)如年齡、性別、BMI、BPRS等進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在兩組樣本中均未發(fā)現(xiàn)與患者的臨床特征存在顯著相關(guān)。分析結(jié)果見圖5。

圖5 SCZ組和HC組組間差異性菌群與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 腸道微生物功能預(yù)測(cè)

2.5.1 KEGG功能預(yù)測(cè) 使用PICRUSt工具對(duì)所有的基因序列基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)菌群功能，選取豐度最高的功能進(jìn)行分類，進(jìn)行相對(duì)豐度計(jì)算，獲得相對(duì)豐度文件，繪制樣品豐度比較的柱狀圖，柱狀圖以堆疊柱狀圖形式展現(xiàn)。

在KEGG L1上，新陳代謝、遺傳信息處理和細(xì)胞過程的功能在兩組樣本中豐度較高，而在生物系統(tǒng)、人類疾病、環(huán)境信息處理的功能豐度較低。在KEGG L2上，兩組在輔助因子和維生素代謝、心血管疾病、氨基酸代謝、其他氨基酸代謝及萜類和多酮類化合物的代謝的功能豐度較高。具體如圖6所示。

圖6 SCZ組和HC組菌群在KEGG 各層級(jí)的功能相對(duì)豐度分析

另外根據(jù)Lefse方法確定SCZ組和HC組患者的KOs相對(duì)豐度差異。在KEGG L1，兩組樣本在新陳代謝、遺傳信息處理和生物系統(tǒng)三個(gè)方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P(FDR)均＜0.05]，另外，SCZ組在新陳代謝的相對(duì)豐度較HC組高[P(FDR)=0.002]，相反，HC組在遺傳信息處理和生物體系統(tǒng)的相對(duì)豐度較SCZ組高[P(FDR)分別為0.002、0.036]。SCZ組和HC組兩組樣本在KEGG L2層級(jí)預(yù)測(cè)功能發(fā)現(xiàn)，29種功能中有7種功能的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面有意義[P(FDR)均＜0.05]，分別是免疫疾病，轉(zhuǎn)錄，傳染病-寄生蟲病，核苷酸代謝，折疊、分類、分解，復(fù)制和修復(fù)，轉(zhuǎn)移。SCZ組、HC組兩組KEGG預(yù)測(cè)功能差異圖如圖7所示。

圖7 SCZ組和HC組兩組在KEGG各層級(jí)預(yù)測(cè)功能差異圖

3 討 論

近十多年來(lái)，腸道微生物已然成為目前研究的熱點(diǎn)，當(dāng)前主流的觀點(diǎn)認(rèn)為，腸道微生物通過微生物-腸-腦軸在各種神經(jīng)精神疾病發(fā)揮作用。但關(guān)于腸道微生物在精神分裂癥中的作用機(jī)制眾說紛紜，未能得出令人滿意的結(jié)論。近年來(lái)基因測(cè)序技術(shù)得到不斷的發(fā)展，關(guān)于精神分裂癥患者腸道微生物結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)等研究隨之越來(lái)越深入。本研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：首先，SCZ組和HC組組間Beta-多樣性的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外進(jìn)行的組間差異性菌群分析結(jié)果提示：在科水平有疣微菌科和毛螺菌科；在屬水平，糞桿菌屬、Butyricicoccus、毛螺菌屬、氏菌屬及桿菌屬；在種水平，普拉梭菌、Butyricicoccus pullicaecorum和Roseburia faecis。其次，SCZ組和HC組在KEGG功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組樣本在KEGG L1、KEGG L2、KEGG L3的部分功能預(yù)測(cè)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，SCZ患者和HC患者的腸道微生物Alpha-多樣性無(wú)差異性，而組間Beta-多樣性差異顯著，但是從圖4顯示的Beta-多樣性PCoA圖和置信橢圓的分布來(lái)看，總體的物種組成上大部分相似，都是以擬桿菌、厚壁菌、放線菌等為主。與本研究結(jié)果類似，不少研究[6-8]發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者的腸道微生物主要是變形桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門發(fā)生了改變。本研究提示，SCZ組和HC組在門水平含有較豐富的擬桿菌、厚壁菌，另外，SCZ組在門水平上的變形菌含量較HC組高。有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，變形菌門的豐度改變與肥胖、炎癥和腸道通透性改變有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在慢性精神分裂癥患者的腸道微生物中，變形菌門有增加[6]或者減少[11]，但在未在口腔微生物中發(fā)現(xiàn)這種情況[12]，這表明變形菌豐度不平衡是腸道微生物所特有的。Castro和他的同事[12]報(bào)告了對(duì)16名精神分裂癥患者和16名HC的口咽微生物組進(jìn)行鳥槍法宏基因組分析的結(jié)果，兩組的口腔微生物在門和屬水平上都存在明顯的差異，在SCZ組和HC組中占比比較高的是變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，而且該研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌包括乳酸桿菌和雙歧桿菌在精神分裂癥中相對(duì)豐富。Shen等[6]研究發(fā)現(xiàn)在門水平上，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者中變形菌的豐度顯著增加，在屬水平上，與健康對(duì)照組相比，琥珀弧菌屬、巨球菌屬、柯林斯菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬和甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度顯著較高，而布氏桿菌屬、糞球菌屬、羅斯氏菌屬的豐度則有所下降。

本研究中，SCZ患者是在服用精神科藥物的情況下進(jìn)行糞便微生物檢測(cè)，故不能排除精神科藥物對(duì)菌群多樣性及豐度的影響。目前也有不少研究在探討精神科藥物對(duì)腸道微生物的影響。Yuan等[13]研究了首發(fā)SCZ患者(n=41)在為期24周利培酮治療后的微生物群變化。使用利培酮干預(yù)前SCZ患者糞便中的雙歧桿菌、大腸桿菌和乳酸桿菌較HC明顯減少，相反，球狀梭菌是增加的，而經(jīng)利培酮治療24周后，減少的雙歧桿菌和大腸桿菌的數(shù)量較前明顯增加，而菌群明顯減少的是球狀芽孢桿菌和乳酸桿菌。還有一些研究集中在腸道微生物群在抗精神病藥物治療中的作用。奧氮平處理后微生物群的改變首先在大鼠中報(bào)道。該研究[14]觀察到微生物菌群總體多樣性降低，在門水平，放線菌和變形桿菌的相對(duì)豐度減少，而厚壁菌的相對(duì)豐度增加，在這項(xiàng)研究中還發(fā)現(xiàn)微生物組成的變化伴隨著體重增加、內(nèi)臟脂肪組織增加以及炎癥和代謝參數(shù)的改變，而且這些改變與性別有關(guān)，即雌性比雄性更明顯。相反，Kao等[15]證明奧氮平給藥對(duì)大鼠腸道微生物群沒有顯著影響。同樣，有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)，在精神分裂癥患者中，用奧氮平治療6周后，腸道微生物群組成沒有改變。但是，這些研究結(jié)果存在不一致，可重復(fù)性低，可能與方法學(xué)、樣本量、地區(qū)、性別、年齡等因素有關(guān)。

本研究還進(jìn)行了SCZ組和HC組的KEGG功能預(yù)測(cè)的相對(duì)豐度差異。在KEGG L1，組間差異在新陳代謝、遺傳信息處理和生物系統(tǒng)三個(gè)方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外，SCZ組在新陳代謝的相對(duì)豐度較HC組高，相反，HC組在遺傳信息處理和生物系統(tǒng)的相對(duì)豐度較SCZ組高。本研究與部分研究結(jié)果類似，Shen等[6]的研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者的功能通路發(fā)生了改變，如亞油酸、維生素B6、半胱氨酸、脂肪酸、淀粉、蔗糖、色氨酸、蛋氨酸等代謝途徑的合成以及一些異源物質(zhì)的降解。而在Yang等[17]的研究中，發(fā)現(xiàn)與高危受試者、健康對(duì)照相比，超高危受試者關(guān)于預(yù)測(cè)丙酮酸合成，乙酰輔酶A合成和脂肪酸生物合成起始途徑的短鏈脂肪酸是顯著增加的，此外，在同一研究里，Yang等[17]發(fā)現(xiàn)，與高危受試者、健康對(duì)照相比，超高危受試者的膽堿水平也顯著升高。Yang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)超高危受試者的腸道微生物群和影像學(xué)研究都表明腦膜功能障礙，有力地支持精神分裂癥的微生物-腸腦軸假說。

回顧本研究，主要存在以下不足：一是我們的研究是一項(xiàng)橫斷面研究，這限制了探索腸道微生物與精神分裂癥的動(dòng)態(tài)變化。其次，本研究的樣本量很小，限制了探索腸道微生物差異的潛在混雜因素。三是本研究納入的人群是長(zhǎng)期服用精神科藥物，研究中未能排除精神科藥物對(duì)腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的影響。

本研究通過16S RNA基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)SCZ患者腸道微生物結(jié)構(gòu)特征及其代謝功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，精神分裂癥患者的腸道微生物多樣性和結(jié)構(gòu)上發(fā)生顯著差異，支持前人的研究結(jié)果。最后，本研究在對(duì)具有差異性的腸道微生物的代謝通路分析中發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的KOs。綜上所述，基于16S RNA基因測(cè)序技術(shù)，本研究進(jìn)一步豐富了精神分裂癥腸道微生物結(jié)構(gòu)及代謝方面的研究，為闡明精神分裂癥的病理生理學(xué)機(jī)制提供了理論數(shù)據(jù)，有利于尋找精神分裂癥的特異性的腸道微生物標(biāo)記物。