尹治清 陸 曉

安陽市腫瘤醫(yī)院介入科 (河南 安陽 433000)

膽管癌是發(fā)生于左、右肝管至膽總管下端的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有所升高。目前臨床對膽管癌的早期治療仍以手術為首選治療方案，但患者早期確診率低，行根治性切除治療的切除率也較低，大部分患者術后仍然出現(xiàn)復發(fā)及轉移，預后不佳[1-2]。浸潤、轉移、侵襲是惡性腫瘤的生物學表現(xiàn)[3]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1(HMGB1)與惡性腫瘤的發(fā)生及進展密切相關，在胃癌[4]、非小細胞肺癌[5]等多種惡性腫瘤中高表達。金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)與腫瘤細胞的侵襲、轉移密切相關，可通過破壞細胞外基質，促進癌細胞突破組織學屏障[6-7]。本研究檢測并比較膽管癌組織中HMGB1和MMP-9的表達情況，并分析其臨床意義，為患者的臨床治療及預后評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源選取2015年6月至2018年9月于安陽市腫瘤醫(yī)院治療的75例膽管癌患者，采集所有患者術中切除病理組織標本75例，另采集距腫瘤組織至少6cm處的正常癌旁組織。

納入標準：均經(jīng)病理學診斷確診；行根治術治療；手術情況及隨訪記錄清晰；由同組醫(yī)師完成手術；預計生存期1年以上；臨床資料完整。排除標準：術前接受過任何抗腫瘤治療；合并其他系統(tǒng)腫瘤；合并嚴重器官功能障礙者等。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑及儀器 鼠抗人HMGB1、MMP-9多克隆抗體：英國Abcam公司。免疫組化試劑盒：北京中杉生物技術有限公司。CKX41-A32RC型倒置顯微鏡：日本Olympus公司等。

1.2.2 免疫組化方法 將切取的組織標本制備石蠟組織切片，并按照免疫組化的實驗方法進行脫蠟，水化，過氧化氫封閉內源性過氧化物酶處理后，滴加鼠抗人HMGB1、MMP-9多克隆抗體，最后經(jīng)蘇木精復染封片后，于倒置顯微鏡下觀察膽管癌組織及癌旁正常組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達情況。

1.2.3 免疫組化判定標準 HMGB1、MMP-9蛋白陽性著色以細胞核或細胞質中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為準，以半定量積分法判定陽性細胞百分比評分(共4分)和染色強度評分(共3分)。染色總評分=陽性細胞數(shù)評分×陽性染色強度評分。陰性：染色總評分為0～4分；陽性：染色總評分≥4分[8]。

1.2.4 隨訪 隨訪截止日期為2021年9月31日，以術后死亡作為終點事件，分析患者術后總體生存情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析，HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率均以(%)表示，采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 膽管癌組織及癌旁正常組織HMGB1、MMP-9蛋白表達情況比較HMGB1陽性表達主要分布于細胞核，MMP-9蛋白陽性表達主要分布于癌細胞胞漿和部分組織間質內，陽性著色呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，見圖1。膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率分別為64.00%、72.00%，顯著高于癌旁正常組織17.33%、13.33%(P＜0.05)，見表1。

表1 膽管癌組織及癌旁正常組織中HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率比較[n(%)]

圖1 免疫組化染色觀察膽管癌組織及癌旁正常組織HMGB1、MMP-9蛋白表達(×200)。圖1A：HMGB1蛋白陰性表達; 圖1B：HMGB1蛋白陽性表達; 圖1C：MMP-9蛋白陰性表達; 圖1D：MMP-9蛋白陽性表達。

2.2 膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達相關性分析膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達雙陽性的有42例，占比56.00%，雙陰性的有15例，占比20.00%，HMGB1(+)MMP-9(-)有6例，占比8.00%，HMGB1(-)MMP-9(+)有12例，占比16.00%，肝癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達呈顯著正相關(r=0.569，P=0.002)，見表2。

表2 膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達相關性分析[n(%)]

2.3 膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達與臨床病理特征的關系膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達與臨床病理特征的關系分析可見，有門靜脈浸潤、淋巴結轉移及低分化程度的患者HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率高于無門靜脈浸潤、無淋巴結轉移及中高分化程度的患者(P＜0.05)，膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑無明顯相關性(P＞0.05)，見表3。2.4 膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達與患者預后隨訪結束后，經(jīng)統(tǒng)計，死亡36例，存活39例，生存率為52.00%，與HMGB1陰性表達患者(74.07%)比較，HMGB1陽性表達患者生存率(39.58%)均顯著降低(P＜0.05)。與MMP-9陰性表達(76.19%)患者比較，HMGB1陽性表達患者生存率(42.59%)均顯著降低(P＜0.05)。

表3 膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討 論

深入研究膽管癌發(fā)生惡性侵襲、轉移的機制，可從分子水平上尋找到評估的標記基因，對疾病的基因和分子靶向治療等提供新的策略和思路，對制定有效的腫瘤防治方案、延長生存期、降低復發(fā)率均具有臨床意義[9-10]。

侵襲及轉移是促進惡性腫瘤病情進展，影響患者預后的主要因素。HMGB1可通過與其受體結合，通過促進細胞增殖分化、促進炎癥反應等生物學效應，促進腫瘤形成，并加速惡性進展。HMGB1在多種惡性腫瘤細胞中過表達可以引起一些基因的表達失調，導致細胞腫瘤表型的改變，使獲得腫瘤表型的細胞免疫凋亡，使腫瘤細胞無限制增殖，還可以促進周圍小血管的生成，使腫瘤不斷向周圍浸潤[11-12]。腫瘤轉移的主要屏障是細胞外基質，其基本骨架成分為IV型膠原，而MMP-9是主要降解Ⅳ型膠原的基質蛋白水解酶。MMP-9可破壞基質降解平衡，使癌細胞穿越組織學屏障，侵襲其鄰近周圍組織，并向遠處正常組織轉移，在多種惡性腫瘤組織中高表達[13-14]。

本研究中，免疫組化結果顯示，膽管癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率分別為64.00%、72.00%，顯著高于癌旁正常組織17.33%、13.33%。癌細胞的惡性生物學行為與腫瘤患者的臨床病理參數(shù)、預后等之間的關系逐漸受到臨床的廣泛關注，本研究進一步Spearman秩相關檢驗結果顯示，肝癌組織中HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達呈顯著正相關。有門靜脈浸潤、淋巴結轉移及低分化程度的患者HMGB1、MMP-9蛋白陽性表達率高于無門靜脈浸潤、無淋巴結轉移及中高分化程度的患者。提示HMGB1、MMP-9在膽管癌組織中的陽性表達與患者性別、年齡等均無顯著相關性，而均與患者門靜脈浸潤、淋巴結轉移及分化程度具有顯著相關性。

腫瘤細胞浸潤、轉移過程中腫瘤細胞從原始組織局部脫離下來，穿過細胞外基膜和基質, 并浸潤周圍其他組織、淋巴管和血管[15]。該過程屬于一個動態(tài)的、復雜的多階段過程，其中組織浸潤過程中的關鍵步驟是基底膜和細胞外基質的降解。張小艷等[16]的一項關于MGB1與乳腺癌患者臨床病理學特征及免疫指標的相關性研究結果顯示，HMGB1水平與乳腺癌臨床分期、淋巴結轉移及細胞免疫功能相關，并有助于預測新輔助化療的效果。MMPs是一組細胞外基質的內肽酶的總稱，幾乎能夠水解絕大多數(shù)細胞外基質，目前至少發(fā)現(xiàn)MMPs有28種之多，且在結構上具有較高的同源性，具有廣泛的生物學效應；MMP-9屬于MMPs中明膠酶類，主要生理功能可以降解Ⅳ型膠原和明膠，如果能降低其表達, 有可能會有效地抑制腫瘤的侵襲和轉移[17]。殷敏敏等[18]的一項關于宮頸癌組織中血管內皮生長因子(VEGF)、MMP-9表達與微血管密度的關系的研究結果顯示，宮頸癌組織中MMP-9表達與微血管密度存在密切關系，可用于宮頸良惡性腫瘤鑒別診斷中。本研究中，與HMGB1陰性表達患者(74.07%)比較，HMGB1陽性表達患者生存率(39.58%)均顯著降低。與MMP-9陰性表達(76.19%)患者比較，HMGB1陽性表達患者生存率(42.59%)均顯著降低，提示HMGB1和MMP-9的表達也與膽管癌患者生存周期密切相關，關系到患者預后。

綜上所述，原發(fā)性膽管癌組織中存在HMGB1和MMP-9異常高表達，與患者不良預后有關，在疾病的發(fā)生及進展過程中起協(xié)同作用，本文關于HMGB1和MMP-9在原發(fā)性膽管癌組織中的研究還不足以解釋腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展機制，在促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制還有待于進一步研究。