王鳳華，張晨晨，高文靜，郭澤輝，劉逸寒，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

酶作為生物大分子催化劑，具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點(diǎn)。加氧酶屬于氧化還原酶類，能夠在溫和條件下活化分子氧，從而將底物氧化，是加速生命體氧化反應(yīng)的一類生物酶的總稱。目前，通過(guò)18O示蹤法發(fā)現(xiàn)了兩大類加氧酶：一是催化O2中的兩個(gè)氧原子與底物結(jié)合的雙加氧酶；二是催化O2中的一個(gè)氧原子插入底物，另一個(gè)氧原子與電子供體提供的氫原子結(jié)合生成水的單加氧酶。其中，黃素單加氧酶（flavoprotein monooxygenases，F(xiàn)PMOs）是一類被廣泛應(yīng)用的單加氧酶，其催化反應(yīng)嚴(yán)格依賴輔因子、輔酶，如黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleo-tide，F(xiàn)AD）、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）等，激活 O2[1-2]。

黃素單加氧酶廣泛參與生物反應(yīng)過(guò)程，在化合物的代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。大多數(shù)黃素單加氧酶能夠催化黃素的C4a和分子氧之間形成共價(jià)鍵，從而產(chǎn)生黃素過(guò)氧化物中間體，這種過(guò)氧化黃素中間體在黃素單加氧酶的作用下能夠進(jìn)一步氧化目標(biāo)底物[4]。黃素單加氧酶在反應(yīng)中可催化羥基化、拜爾-維利格氧化、硫氧化、環(huán)氧化和鹵化反應(yīng)，具有的高區(qū)域選擇性和對(duì)映選擇性使其成為良好的生物催化劑，用于多種高價(jià)值化合物的合成，在食品功能因子蒜氨酸和蘿卜硫素的開(kāi)發(fā)與制備等方面前景廣闊[3]。本文從黃素單加氧酶的分類、特性研究和蛋白質(zhì)工程及其在食品功能因子合成中的應(yīng)用三方面展開(kāi)論述，以期為黃素單加氧酶在食品領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 黃素單加氧酶的分類

氧化還原酶的分類可采用不同的標(biāo)準(zhǔn)，如催化的化學(xué)反應(yīng)類型、還原和氧化底物的性質(zhì)、酶序列或三維結(jié)構(gòu)的同源性等[5]。當(dāng)前黃素單加氧酶基于結(jié)構(gòu)特征、蛋白質(zhì)序列、電子供體和加氧反應(yīng)的類型不同分為8個(gè)亞類：A類、B類、C類、D類、E類、F類、G類、H類[6]。其中，A類、B類、G類、H類黃素單加氧酶由單個(gè)基因編碼，C類～F類黃素單加氧酶由編碼單加氧酶和還原酶組分的兩個(gè)或者多個(gè)基因編碼。A類和B類黃素單加氧酶將單加氧酶和還原酶基因編碼于一條多肽鏈中，以FAD為輔基，NADPH為電子供體完成加氧反應(yīng)，部分A類和B類黃素單加氧酶如水楊酸單加氧酶（salicylate hydroxylase，NahG）以 NADH 作為電子供體[7]。C類～H類黃素單加氧酶則以還原型黃素單核苷酸（reduced flavin mononucleotide，F(xiàn)ADH2）、還原型黃素二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)MNH2）或底物為電子供體完成加氧反應(yīng)。黃素單加氧酶分類見(jiàn)表1。

表1 黃素單加氧酶分類Table 1 Classification of flavoprotein monooxygenases

1.1 A類黃素單加氧酶

A類黃素單加氧酶在催化過(guò)程中需要緊密結(jié)合FAD，具有NADH/NADPH依賴性，主要包含用于FAD結(jié)合的二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該酶以包含活化羥基或氨基的芳香化合物為典型底物，催化過(guò)程中C4a-過(guò)氧化黃素對(duì)芳香環(huán)發(fā)起親電或親核攻擊，NADP+和NAD+則在FAD被還原后直接釋放。A類黃素單加氧酶具有狹窄的底物特異性，通常參與多種芳香化合物的微生物降解[8]，包括已被廣泛研究的熒光假單胞菌對(duì)羥基苯甲酸羥化酶（p-hydroxybenzoic acid hydroxy lase，PHBH）、角鯊烯單加氧酶（squalene monooxyge nase，SQLE）等[9-10]。角鯊烯單加氧酶早期被稱為角鯊烯環(huán)氧化酶，是一種含有FAD的單酶，分子量約為64kDa，其催化的典型反應(yīng)為細(xì)胞色素P450型氧化，能夠使角鯊烯在C=C雙鍵上環(huán)氧化生成2，3-氧化角鯊烯，在催化膽固醇生物合成中起重要作用[11]。最近研究人員解析了SQLE催化結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)[12]，對(duì)其未來(lái)生物催化具有指導(dǎo)性意義。除上述反應(yīng)外，A類黃素單加氧酶還參與了泛醌的生物合成[13]、芳香族聚酮[14]的修飾和生物降解途徑[15-16]。

1.2 B類黃素單加氧酶

與A類黃素單加氧酶類似，B類黃素單加氧酶在催化反應(yīng)過(guò)程中亦需要與之緊密結(jié)合的輔因子FAD，并且依賴于NADPH或NADH作為輔酶。B類黃素單加氧酶結(jié)構(gòu)主要包含F(xiàn)AD和NAD（P）H兩個(gè)二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在整個(gè)催化過(guò)程中始終保持NADP+的結(jié)合[2，17]。Cho 等[18]發(fā)現(xiàn) NADP+的結(jié)合可能穩(wěn)定了黃素過(guò)氧化物中間體。由于B類黃素單加氧酶能夠氧化底物分子上的碳原子、硫原子和其他（雜）原子，因此又被稱為多功能含黃素的單加氧酶，其介導(dǎo)的氧化反應(yīng)具有立體、化學(xué)和區(qū)域選擇性高的特點(diǎn)。因此，幾十年來(lái)越來(lái)越多的B類黃素單加氧酶被鑒定、克隆、重組表達(dá)、工程化并用于生物催化。B類黃素單加氧酶包含兩個(gè)典型的Rossman折疊基序（GxGxxG），一個(gè)Rossman折疊基序位于N端附近，另一個(gè)位于序列中間部位。根據(jù)序列相關(guān)性，已有的B類黃素單加氧酶可進(jìn)一步分為3個(gè)亞類：拜爾-維利格單加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenases，BVMOs）、含黃素的單加氧酶（flavincontaining monooxygenases，F(xiàn)MOs）和 N-羥基化單加氧酶（N-hydroxylating monooxygenases，NMOs）[19-20]。

1.2.1 拜爾-維利格單加氧酶

在有機(jī)化學(xué)中，酮氧化產(chǎn)生酯或內(nèi)酯被稱為拜爾-維利格氧化。拜爾-維利格單加氧酶包含序列基序FxGxxxHxxxWP/D，主要催化含雜原子化合物（N、S、B或Se化合物）的加氧，具有較高的立體、區(qū)域和化學(xué)選擇性。由于拜爾-維利格單加氧酶的產(chǎn)物手性內(nèi)酯是合成天然產(chǎn)物和類似物的重要中間體，因此，越來(lái)越多的拜爾-維利格單加氧酶被廣泛研究[21]。從醋酸鈣不動(dòng)桿菌中獲得的環(huán)己酮單加氧酶（cyclohexanone monooxygenase，CHMO）是一種重要的單加氧酶，其能夠催化多種酮類的選擇性氧化從而實(shí)現(xiàn)底物的對(duì)稱化反應(yīng)、區(qū)域性氧化以及動(dòng)力學(xué)拆分等[22]，是強(qiáng)大生物催化劑；目前，CHMO可在大腸桿菌中高效表達(dá)，并已獲得其與底物環(huán)己酮、NADP+和FAD復(fù)合物2.4 ?分辨率的三維空間結(jié)構(gòu)[23]，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。另一種被廣泛研究的拜爾-維利格單加氧酶為來(lái)自褐色嗜熱裂孢菌的苯丙酮單加氧酶（phenylacetone monooxygenase，PAMO），其編碼序列從褐色嗜熱裂孢菌基因組DNA中克隆獲得，并利用pBAD/myc-HisA衍生載體pBADNK在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)；研究表明，苯丙酮單加氧酶能夠催化苯丙酮氧化生成乙酸芐酯，此外該酶還能催化芳香酮族、脂肪酮族、有機(jī)硫化物以及含氮化合物和硼原子發(fā)生氧化反應(yīng)，具有耐受高溫和有機(jī)溶劑的特征[24-25]；另外，Yang等[25]和Dudek等[26]分別通過(guò)蛋白質(zhì)工程和催化反應(yīng)條件優(yōu)化等方法提高了PAMO催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，增加了酶催化底物的選擇性。最近，一種新的參與黃曲霉毒素生物合成的細(xì)菌I型拜爾-維利格單加氧酶MoxY被鑒定為羥基異色酮/異色酮單加氧酶，其可將黃曲霉毒素合成的中間產(chǎn)物羥基異色酮（hydroxyversicolorone，HVN）轉(zhuǎn)化為乙酸異丙醇半縮醛（versiconal hemiacetal acetate，VHA），異色酮（versicolorone，VN）轉(zhuǎn)化為乙酸異丙醇（versiconol acetate，VOAc）；若moxY基因被破壞，則導(dǎo)致HVN和VN的積累，進(jìn)而引發(fā)黃曲霉毒素的合成量減少[27-28]。BVMOs在自然界中分布廣泛，參與非典型碳源的初級(jí)代謝以及有毒或有用的復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，如抗生素、抗癌劑和抗增殖劑。作為一種化學(xué)拜爾-維利格氧化的替代物，其更為環(huán)保，并且具有更為良好的區(qū)域和對(duì)映選擇性。

1.2.2 含黃素的單加氧酶

與其他B類黃素單加氧酶相比，F(xiàn)MOs具有獨(dú)特的序列基序FxGxxxHxxxYK/R，用于特異性催化含雜原子化合物的氧化，對(duì)拜爾-維利格氧化反應(yīng)的催化效率非常低。FMOs最初在肝微粒體中被鑒定，并命名為“混合功能氧化酶”，后更名為含黃素的單加氧酶。FMOs普遍存在于哺乳動(dòng)物和真核生物中，包括多種亞型，定位于不同組織，并具有不同的底物特異性。人類基因組中發(fā)現(xiàn)了共計(jì)6個(gè)FMO基因，其中FMO3是最重要的亞型[29]。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)MOs負(fù)責(zé)含氮和含硫化合物的解毒作用[30]。近期多種人源和哺乳動(dòng)物FMOs的結(jié)構(gòu)解析取得了突破性進(jìn)展[31-32]。與哺乳動(dòng)物FMOs相比，酵母FMOs不氧化含氮化合物，只與生物硫醇發(fā)生作用，酵母細(xì)胞通過(guò)FMOs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中制造氧化環(huán)境從而實(shí)現(xiàn)含二硫鍵蛋白的正確折疊[33]。目前，基因組分析表明，F(xiàn)MOs基因在植物中十分常見(jiàn)，如參與次生植物代謝物N-羥基-哌啶酸生物合成的植物來(lái)源的含黃素單加氧酶1[34-35]，參與多功能植物激素吲哚-3-乙酸生物合成的吲哚-3-丙酮酸單加氧酶（in dole-3-pyruvate monooxygenase）[36]以及具有亞砜化活性的大蒜來(lái)源的含黃素單加氧酶（Allium sativum flavincontaining monooxygenase 1，AsFMO1）[37]。與其它真核生物FMOs相比，細(xì)菌FMOs相對(duì)較少，但其更易于表達(dá)成為可溶性蛋白。因此，細(xì)菌FMOs逐漸發(fā)展成為有潛力的生物催化劑。

1.2.3 N-羥基化單加氧酶

N-羥基化單加氧酶與B類黃素單加氧酶具有序列同源性，但缺乏典型的序列基序FxGxxxHxxx[38]。當(dāng)前，只有少數(shù)來(lái)源于細(xì)菌和真菌的NMOs被報(bào)道，這些NMOs通過(guò)催化L-鳥(niǎo)氨酸、L-賴氨酸、腐胺和尸胺的末端胺的N-羥基化，參與羥胺基苷酸的生物合成。Robinson等[39]研究發(fā)現(xiàn)NMOs中的鳥(niǎo)氨酸單加氧酶（ornithine monooxygenase，OMO）能夠催化 L-鳥(niǎo)氨酸的羥基化反應(yīng)為N5-羥基-L-鳥(niǎo)氨酸，而鳥(niǎo)氨酸N5-羥基化是生產(chǎn)天然產(chǎn)品重要非蛋白源構(gòu)件哌嗪鹽的第一步反應(yīng)[40]。

1.3 C類～F類黃素單加氧酶

C類～F類黃素單加氧酶一般由還原酶和單加氧酶兩個(gè)具有不同功能的多肽鏈組分組成。還原酶組分主要完成黃素的還原，而單加氧酶組分則通過(guò)分子氧氧化對(duì)應(yīng)底物。這些多組分酶系統(tǒng)的單加氧酶僅有少數(shù)結(jié)構(gòu)被解析。

C類黃素單加氧酶是一種TIM-barrel酶，它能從依賴NAD（P）H的黃素還原酶中獲得FMN；其成員有細(xì)菌熒光素酶（bacterial luciferase，LUX）和烷磺酸單加氧酶（alkanesulfonate monooxygenase，SsuD），可分別實(shí)現(xiàn)醛氧化和脫硫（拜爾-維利格氧化），同時(shí)能夠催化亞砜化、環(huán)氧化和羥基化反應(yīng)[41-44]。

D類黃素單加氧酶能夠結(jié)合FADH2/FMNH2，從依賴NAD（P）H的黃素還原酶獲得還原型的FAD/FMN；目前已知的D類酶有近幾十種，能夠催化芳香羥基化或N-羥基化反應(yīng)等。

E類黃素單加氧酶是具有PHBH（GR-2）折疊的環(huán)氧酶[45]，可從利用NADH的黃素還原酶獲得FAD。例如，E類發(fā)現(xiàn)的苯乙烯單氧合酶（styrene monooxygenase，SMO），能夠?qū)⒈揭蚁┭苌镛D(zhuǎn)化為相應(yīng)的（S）-苯乙烯氧化物[6]。

F類黃素單加氧酶可催化活化有機(jī)分子的區(qū)域選擇性氯化和溴化反應(yīng)，其代表性酶色氨酸-7-鹵代酶（tryptophan-7-halogenase，PrnA）的催化反應(yīng)機(jī)制是生成黃素過(guò)氧物中間體，進(jìn)而與氯離子反應(yīng)生成次氯酸[6]。

1.4 G類、H類黃素單加氧酶

G類和H類黃素單加氧酶是通過(guò)底物氧化還原黃素輔因子的單組分酶，主要催化氧化脫氨和氧化脫羧反應(yīng)。G類黃素單加氧酶以氨基酸底物作為電子供體，其催化反應(yīng)分為還原半反應(yīng)和氧化半反應(yīng)；反應(yīng)過(guò)程中首先裂解氨基酸的α-CH鍵，形成與酶結(jié)合的亞胺酸，然后亞胺酸氧化脫羧最終形成酰胺。H類黃素單加氧酶具有TIM-barrel折疊，能夠結(jié)合FMN，通過(guò)底物氧化還原黃素輔因子，此亞類的代表性酶是乳酸-2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase），可催化 L-乳酸氧化為醋酸鹽、水和二氧化碳[6，41]。

2 黃素單加氧酶的特性及蛋白質(zhì)工程

隨著分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程和生物信息學(xué)的發(fā)展，黃素單加氧酶得到了廣泛的生化和結(jié)構(gòu)表征。通過(guò)對(duì)目的基因的高通量篩選，應(yīng)用分子生物學(xué)和發(fā)酵工程等技術(shù)已獲得多種高表達(dá)的黃素單加氧酶。利用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等蛋白質(zhì)工程技術(shù)，擴(kuò)大了酶的催化底物范圍，開(kāi)發(fā)出多種具有獨(dú)特性質(zhì)的生物催化劑，成熟生物催化劑開(kāi)發(fā)流程見(jiàn)圖1。

圖1 開(kāi)發(fā)成熟生物催化劑的全流程Fig.1 Full process of developing a mature biocatalyst

2.1 黃素單加氧酶的表達(dá)與催化條件優(yōu)化

2.1.1 表達(dá)條件優(yōu)化

Van等[52]將PAMO作為BVMOs的模型，采用逐步改進(jìn)的策略來(lái)提高PAMO在重組大腸桿菌中的表達(dá)水平，結(jié)果表明在30℃、0.2% L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下每毫克細(xì)胞可產(chǎn)生160 nmol/h PAMO，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)6 h內(nèi)乙酸芐酯的生成相對(duì)穩(wěn)定，4 h時(shí)誘導(dǎo)效果最佳。Riebel等[53]通過(guò)改變溫度、阿拉伯糖濃度以及利用NADPH依賴性黃素還原的方法將來(lái)自紅球菌RHA1的22個(gè)BVMO編碼基因均以可溶性活性酶的形式進(jìn)行表達(dá)。Dudek等[26]開(kāi)發(fā)了一種基于周質(zhì)表達(dá)PAMO的篩選方法，通過(guò)從施氏假單孢菌WM88中添加的亞磷酸鹽脫氫酶（phosphite dehydrogenase，PTDH）使底物完全與酶結(jié)合并促進(jìn)NADPH回收。另外，重組的PAMO蛋白在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中得以功能性表達(dá)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了該系統(tǒng)與基于亞磷酸鹽脫氫酶的再生系統(tǒng)連用完成生物轉(zhuǎn)化。

2.1.2 催化反應(yīng)過(guò)程優(yōu)化

黃素單加氧酶生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化策略包括輔因子再生系統(tǒng)開(kāi)發(fā)、原位底物進(jìn)料和產(chǎn)物去除（substrate feeding and product removal，SFPR）技術(shù)、全細(xì)胞催化以及溶劑工程等。

黃素單加氧酶催化反應(yīng)多數(shù)嚴(yán)格依賴于輔因子NADPH，然而NADPH的高成本限制了酶的實(shí)際應(yīng)用，因此開(kāi)發(fā)輔因子再生系統(tǒng)成為催化反應(yīng)過(guò)程優(yōu)化的重要一部分。利用細(xì)胞自身產(chǎn)生的NADPH進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可有效避免或減少NADPH的補(bǔ)充。細(xì)胞內(nèi)的輔酶再生系統(tǒng)通常基于耦合酶反應(yīng)，用于NADPH再生的典型酶包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、亞磷酸鹽脫氫酶、醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶。Kohl等[54]采用多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)NADPH輔因子的再生，即通過(guò)構(gòu)建環(huán)己酮單加氧酶與乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）共表達(dá)的質(zhì)粒載體pRSFDuet在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)輔因子再生，與來(lái)自兩個(gè)單獨(dú)質(zhì)粒分別表達(dá)相比，兩個(gè)基因串聯(lián)共表達(dá)的細(xì)胞對(duì)底物環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化率更高。Valencia等[55]將PTDH和BVMO進(jìn)行融合，獲得PTDH-BVMO融合蛋白，能夠使系統(tǒng)中BVMO所需的NADPH實(shí)現(xiàn)自給自足。Lee等[56]研究發(fā)現(xiàn)，酵母中的NADH激酶在產(chǎn)生CHMO的大腸桿菌細(xì)胞中可以將NADH直接磷酸化為NADPH，與缺乏NADH激酶的對(duì)照相比，這種方法增強(qiáng)了分批補(bǔ)料生物轉(zhuǎn)化中環(huán)己酮的氧化，并使產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率提高了一倍。Wang等[57]提出了一種提高NADPH生物利用度的策略，即用枯草芽孢桿菌的NADP+依賴性gapB基因替換大腸桿菌中的天然NAD+依賴甘油醛-3-磷酸脫氫酶gapA基因，提高了NADPH利用度。Masuyama等[58]描述了一個(gè)釀酒酵母全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)，在表達(dá)酵母來(lái)源的含黃素單加氧酶（yeast flavin-containing monooxygenase，YFMO）的同時(shí)表達(dá)UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，無(wú)需添加UDP-葡萄糖醛酸而獲得葡萄糖醛酸苷類化合物；此外，在酵母中使用硫磺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)系統(tǒng)能合成磺基共軛物，而過(guò)程中不需要添加昂貴的輔助因子3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸鹽，這種新的酵母表達(dá)系統(tǒng)可能成為生產(chǎn)N-或S-氧化物的有力工具。Delgove等[59]將來(lái)自Thermocrispum urbane的熱穩(wěn)定性環(huán)己酮單加氧酶與來(lái)自嗜酸嗜熱原胞菌的葡萄糖脫氫酶共固定，用于NADPH輔因子再生。研究發(fā)現(xiàn)與在補(bǔ)料分批策略中應(yīng)用的可溶性酶相比，共固定化可提供最有效的生物催化劑，在15個(gè)再利用循環(huán)中平均轉(zhuǎn)化率為83%，生物催化劑產(chǎn)率提高50倍。這種固定化的生物催化劑有助于環(huán)己酮單加氧酶在大規(guī)模生物氧化過(guò)程中的應(yīng)用。由此可見(jiàn)，全細(xì)胞生物催化和酶的固定化在黃素單加氧酶生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化中有著廣闊的發(fā)展前景。

SFPR技術(shù)允許生物轉(zhuǎn)化過(guò)程使用超過(guò)毒性水平的底物濃度，并避免由于底物或產(chǎn)物在體系中的濃度過(guò)高而產(chǎn)生的抑制反應(yīng)。Mihovilovic等[60]在生物反應(yīng)器中利用原位SFPR技術(shù)對(duì)叢毛單胞菌中的環(huán)戊酮單加氧酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將4-甲基環(huán)己酮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的內(nèi)酯，使得內(nèi)酯的分離產(chǎn)率高達(dá)70%。Solé等[61]研究了來(lái)自Thermocrispum urbane的環(huán)己酮單加氧酶催化3，3，5-三甲基-環(huán)己酮氧化為三甲基-ε-己內(nèi)酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中試工廠規(guī)模（100 L反應(yīng)容器）反應(yīng)9 h后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%，總分離的三甲基-ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率為76%。此外，Pazmi?o等[62]通過(guò)將氨基酸殘基Met446突變?yōu)镚ly增強(qiáng)了PAMO介導(dǎo)的幾種前手性硫醚氧化的立體選擇性。Gonzalo等[63]進(jìn)一步探索了溶劑工程方法擴(kuò)大野生型和M446G PAMO的應(yīng)用，在緩沖液/共溶劑的17種組合中評(píng)估了芐基甲基硫醚的氧化，并與水介質(zhì)中的反應(yīng)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在含有5%甲醇的Tris-HCl（pH9.0）中進(jìn)行的反應(yīng)使相應(yīng)的亞砜具有高轉(zhuǎn)化率和良好的對(duì)映體比率。

2.2 黃素單加氧酶的蛋白質(zhì)工程

黃素單加氧酶有8個(gè)亞類，具有不同的性質(zhì)，能夠催化不同的反應(yīng)，但應(yīng)用條件非常有限。因此，深入了解黃素單加氧酶的三維空間結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制，利用蛋白質(zhì)工程對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化及合理設(shè)計(jì)，對(duì)提高酶的對(duì)映體選擇性、區(qū)域選擇性、擴(kuò)寬酶的底物范圍等方面具有重要意義。Romero等[64]對(duì)一種來(lái)自于Thermocrispum municipal DSM 44069的環(huán)己酮單加氧酶（Thermocrispum municipal cyclohexanone monooxygenase，TmCHMO）進(jìn)行了純化、表征、晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定以及底物特異性研究。Li等[65]對(duì)熱穩(wěn)定的TmCHMO底物結(jié)合口袋進(jìn)行了迭代飽和突變，實(shí)現(xiàn)了該酶對(duì)底物4-苯基-2-丁酮的區(qū)域選擇性從99∶1到2∶98的逆轉(zhuǎn)。為了進(jìn)一步擴(kuò)大酶的底物譜，Zhang等[66]采用蛋白質(zhì)工程改變CHMO鄰近底物通道的活性位點(diǎn)，使底物特異性從環(huán)己酮單氧合作用轉(zhuǎn)向奧美拉唑硫氧化，從而有利于合成藥物奧美拉唑。Yang等[25]通過(guò)迭代位點(diǎn)特異性突變將耐高溫苯丙酮單加氧酶的底物范圍擴(kuò)展到環(huán)己酮，獲得的最佳突變體I67Y/P440F，在10 h內(nèi)將環(huán)己酮轉(zhuǎn)化為ε-己內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)99%。Woo等[67]選擇了來(lái)自惡臭假單胞菌KT2440的BVMO與可溶性多離子肽標(biāo)簽[即六-谷氨酸（E6）]融合后的重組酶（E6BVMO），將302位的半胱氨酸突變?yōu)榱涟彼幔瑥亩@得了在氧化和應(yīng)激下更為穩(wěn)定的酶（E6BVMOC-302L），該酶在優(yōu)化催化條件后8 h內(nèi)酯的生產(chǎn)濃度為132 mmol/L（41 g/L）。Shirey等[68]將一種黃素依賴的 N-羥基化單加氧酶SidA中參與結(jié)合NADPH焦磷酸部分的Ser257突變?yōu)锳la，其活性受到較大影響，表明該絲氨酸對(duì)于NADP+的正確定位十分重要，能夠穩(wěn)定黃素過(guò)氧化物中間體。Valentino等[37]在大腸桿菌中異源表達(dá)了大蒜來(lái)源的含黃素單加酶，解析了AsFMO1與FAD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，然而研究發(fā)現(xiàn)AsFMO1在催化底物 S-烯丙基-L-半胱氨酸（S-allyl-L-cysteine，SAC）時(shí)幾乎沒(méi)有活性；SAC模型表明當(dāng)S原子靠近黃素C4a時(shí)，可能沒(méi)有足夠的空間容納SAC的3個(gè)末端C原子；鑒于蛋白質(zhì)工程改造已經(jīng)成功應(yīng)用于CHMO、PAMO、BVMO等，極有可能實(shí)現(xiàn)通過(guò)定點(diǎn)突變使AsFMO1催化SAC產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物。

近些年，B類黃素單加氧酶在表達(dá)條件優(yōu)化、催化反應(yīng)優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程改造3個(gè)方面不斷發(fā)展，研究工作者可以按照應(yīng)用目的特定改造獲得具有良好特性的酶。B類黃素單加氧酶在生化和結(jié)構(gòu)表征方面的成功，推動(dòng)了其在食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

3 黃素單加氧酶在食品功能因子制備方面的應(yīng)用

3.1 蒜氨酸的制備

目前，研究表明黃素單加氧酶參與食品功能因子蒜氨酸的生物合成。蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜）是大蒜中主要的含硫化合物之一[69]，為在組織受損時(shí)產(chǎn)生的藥用和風(fēng)味化合物的主要來(lái)源。蒜氨酸是半胱氨酸的衍生物，具有碳中心和硫中心的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)[70]。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蒜氨酸具有降血糖、降脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射等生物活性，同時(shí)可作為調(diào)味品[71]，在不同條件下與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，增加食品的甜味、咸味和鮮味，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，一些動(dòng)物來(lái)源的含黃素單加氧酶能夠?qū)-烯丙基-L-半胱氨酸進(jìn)行S-氧化生成蒜氨酸，由此推測(cè)，在蔥屬植物中蒜氨酸的生物合成過(guò)程，含黃素的單加氧酶參與了S-氧化反應(yīng)[72]。Yoshimoto等[73]發(fā)現(xiàn)了一種大蒜來(lái)源的含黃素單加氧酶AsFMO1，可催化SAC素進(jìn)行S-氧化反應(yīng)合成蒜氨酸。因此，近幾年蒜氨酸的生物制備受到了廣泛的關(guān)注。

3.2 硫代葡萄糖苷的制備

十字花科蔬菜的抗癌作用通常歸因于天然產(chǎn)物硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）的分解所產(chǎn)生的異硫氰酸鹽。由4-甲基亞磺酰基烷基硫代葡萄糖苷分解產(chǎn)生的異硫氰酸鹽，被認(rèn)為具有抗癌特性。Hansen等[74]鑒定了一種擬南芥黃素單加氧酶，體內(nèi)研究表明該酶可實(shí)現(xiàn)幾乎全部的甲硫烷基硫代葡萄糖苷向甲基亞磺?；榛咸烟擒盏霓D(zhuǎn)化，對(duì)生產(chǎn)富含預(yù)防癌癥的蘿卜硫素的功能食品具有重要意義。

4 結(jié)論與展望

黃素單加氧酶來(lái)源廣泛，存在于絕大多數(shù)動(dòng)植物、真菌和細(xì)菌中。由于其具有多種優(yōu)良的性能，可用于蒜氨酸和蘿卜硫素等多種保健和功能性食品的生產(chǎn)。截至目前，黃素單加氧酶家族已包含大約300種已知生理功能的酶，根據(jù)序列相似性和結(jié)構(gòu)特征分為A類～H類。通過(guò)基因挖掘和蛋白質(zhì)工程等手段，目前多種具有高對(duì)映選擇性、高氧化活性和高熱穩(wěn)定性的黃素單加氧酶生物催化劑逐漸被開(kāi)發(fā)。野生型及突變型黃素單加氧酶數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，可催化新的氧化反應(yīng)，從而進(jìn)一步用于各工業(yè)領(lǐng)域。隨著高通量篩選和蛋白質(zhì)工程、多酶級(jí)聯(lián)策略、固定化等技術(shù)的快速發(fā)展，大數(shù)據(jù)及人工智能、多酶定向共固定化、納米載體等逐步延伸至更多不同功能黃素單加氧酶的發(fā)現(xiàn)及表征、結(jié)構(gòu)及功能機(jī)制解析、應(yīng)用拓展等，從而使其成為具有巨大潛力和發(fā)展前景的生物催化劑。